MÉTODOS DE SIEMBRA Y
CULTIVO DE MICROORGANISMOS:
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de la muestra (inóculo) en un medio
de cultivo adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano.
La técnica aséptica en el laboratorio se refiere a las prácticas que reducen la posibilidad de que los microorganismos entren en el material estéril.
Pasos:
A) Esterilización del ansa en la llama
B) Se retira el tapón del tubo con ayuda de los dedos meñique e índice
C) Se flamea el extremo del tubo para esterilizar
D) Se introduce en el tubo el ansa esterilizada
E) Se retira el ansa y se vuelve a esterilizar
el extremo del tubo
F) Se tapa el tubo y se transfiere el ansa al interior de otro tubo estéril
Cultivos en medios sólidos:
Siembra en picadura o punción:
Esta técnica permite conocer el comportamiento de
los microorganismos frente al oxígeno y su movilidad.
Siembras en estrías:
Esta técnica constituye un medio adecuado para el cultivo de microorganismos aerobios y aerobios facultativos.
Siembra por agotamiento en estrías:
Se obtienen colonias aisladas en las últimas estrías, separadas unas de otras, permitiendo a partir de las mismas la obtención de cultivos puros mediante resiembra en otro medio de cultivo.
Siembra por espátula Digralsky:
Permite sembrar inóculos sobre superficies grandes, para obtener un crecimiento confluente. También puede utilizarse para un recuento de colonias; para cumplir con este último objetivo, previamente se deben realizar diluciones seriadas de la muestra.
Siembra con hisopo:
Esta técnica permite sembrar inóculos abundantes sobre superficies grandes a los fines de obtener un crecimiento confluente.
Siembra en placa:
Esta técnica permite el desarrollo de microorganismos aerobios, aerobios facultativos y microaerófilos.
Cultivos en medios líquidos:
Se lleva el material con ansa en anillo o pipeta a un recipiente (frasco Erlenmeyer o tubo) conteniendo el medio de cultivo líquido. Generalmente este tipo de siembra se utiliza para aumentar el número de microorganismos.
Influencia del medio ambiente físico:
Temperatura:
Las elevadas temperaturas afectan principalmente a las reacciones catalizadas por enzimas.
La dependencia de la temperatura de un microorganismo se caracteriza por sus TEMPERATURAS CARDINALES
(mínima, optima y máxima)
Clasificación de los microoganismos de acuerdo a sus temperaturas cardinales:
Psicrófilos:
Pueden crecer a 0° C, pero tienen una temperatura óptima de crecimiento de aproximadamente 15° C. Estos microorganismos rara vez causan problemas en la conservación de los alimentos.
Psicrótrofos (psicrófilos facultativos):
Pueden proliferar a 0° C, pero tienen temperaturas óptimas de crecimiento más elevadas (20 a 30° C). Son más comunes que los psicrófilos y probablemente están implicados en el deterioro de los alimentos a bajas temperaturas.
Mesófilos:
Presentan una temperatura óptima de crecimiento de 25 a 40° C. Son el tipo más común de microorganismos y comprenden a microorganismos que causan deterioro en los alimentos y enfermedades en el hombre y animales
Termófilos:
Muchos de ellos tienen una temperatura óptima de 50 a 60° C y varios de ellos no pueden desarrollar a temperaturas inferiores a los 45° C. No constituyen un problema en salud pública y son importantes en los montículos de compost.
Hipertermófilos:
En ocasiones son llamados termófilos extremos. Tienen una temperatura óptima de crecimiento de 80° C o más, viven en fuentes termales asociadas a la actividad volcánica.
Acidez y alcalinidad:
Cada microorganismo tiene un intervalo de pH, dentro del cual es posible el crecimiento. Además, cada organismo muestra un valor óptimo bien definido de pH para el crecimiento.
Acidófilos:
Crecen entre pH 0 y pH 5; Acidófilos extremos u obligados) Algunas eubacterias del género Thiobacillus (T. Thiooxidans, T. Ferrooxidans) y las arqueas del género Sulfolobus tienen su pH óptimo cercano a 2. De hecho, estas bacterias necesitan esas altas concentraciones de H+ para mantener la integridad de sus membranas y envolturas.
Neutrófilos:
Crecen entre pH 5 y pH 9; Ejemplos: la mayoría de las bacterias (E. Coll, Staphylococcus spp., Pseudomonas spp. Etc.)
Basófilos:
Crecen entre pH 8,5 y pH 11,5 ;Basófilas obligadas tienen óptimos de pH en torno a 10-11. Ejemplo, Bacillus alcalophilus, cuyo pH interno es de 9. Sus hábitats típicos son suelos carbonatados y lagunas alcalinas (algunos son también halófilos, como Natronobacterim gregory).
Oxigeno: Microorganismos aerobicos:
Aerobios estrictos u obligados:
Dependen de la respiración aeróbica para cubrir sus necesidades energéticas. Crecen fácilmente sobre la superficie de placas de agar y en la superficie de los cultivos líquidos en reposo (estáticos). En cultivos líquidos, es necesario airear el cultivo para suministrar la misma concentración de O₂ en todo el cultivo. Poseen las enzimas catalasa, peroxidasa y superoxidismutasa (SOD) para neutralizar las formas tóxicas del O₂ Ejemplos: Micrococcus luteus, Pseudomonas spp.
Microaerófilos:
Son microorganismos aerobios que crecen mejor a presiones parciales de O_{2} considerablemente más bajas (0,2 atm) que las presentes en el aire En medios de cultivo no crecen en la superficie, sino por debajo donde la concentración de O2 es menor. Poseen las enzimas catalasa, peroxidasa y SOD para neutralizar las formas tóxicas del O2 Ejemplos: Campilobacter spp., Spirillum volutans.
Aerobios facultativos:
Pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de 02, pero lo hacen mejor en presencia, en cuyo caso realizan respiración aeróbica. En medios sin O₂ desarrollan mediante respiración anaeróbica o fermentación.
(sigue en el 6)
En los medios de cultivo pueden desarrollar en todo el tubo, tanto en superficie como en profundidad. Poseen las enzimas catalasa, peroxidasa y SOD para neutralizar las formas tóxicas del 02. Ejemplo: Escherichia coli.
Microorganismos anaerobios:
¿Porqué el O2 es tóxico? El O2 no es tóxico, pero se puede convertir en subproductos tóxicos, que dañan o matan las células que no son capaces de contrarrestar su efecto. Estos productos tóxicos se llaman especies reactivas de oxígeno ( O2, H2O2 , HO, etc).
Aerotolerantes:
No requieren ni crecen en presencia de oxígeno y toleran su presencia. Poseen SOD o un sistema equivalente que les permite neutralizar las formas tóxicas del O_{2} Ejemplo: Enterococcus faecalisStreptococcus pyogenes.
Anaerobios estrictos:
Se desarrollan en ausencia de O Realizan respiración anaeróbica o fermentación. Los cultivos líquidos se preparan en tubos o matraces con gran volumen de medio con el agregado de sustancias reductoras, cerrados con tapones de goma o rosca, eliminando el O, por ebullición del medio de cultivo, previo a la siembra. El aislamiento en medios sólidos se realiza mediante la incubación de las cajas de Petri en jarras anaeróbicas de cierre hermético. Carecen de enzimas para neutralizar las formas tóxicas del O₂ Ejemplo: Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium.
Disponibilidad de agua
La disponibilidad de agua no solo depende de la humedad del ambiente, sino que también es función de la concentración de solutos disueltas en el agua presente. Los solutos captan agua y la dejan menos disponible para los organismos.
La disponibilidad de agua se expresa como actividad de agua aw
Medios hipotónicos:
La aw en el exterior > aw que la del citoplasma.
Medios hipotónicos:
La aw
Existen ciertos microorganismos especializados que viven en medios hipertónicos, y en general se llaman osmófilos. Entre los osmófilos podemos distinguir los sacarófilos y los halófilos.
Sacarófilos:
viven en ambientes con altas concentraciones de azúcares. Por ejemplo, las levaduras.
Halófilos:
viven en ambientes con altas concentraciones de sales.
Radiaciones:
Radiación UV: Para que se establezca el efecto de la luz UV sobre los microorganismos estos deben estar expuestos en forma directa. Cuando el procedimiento no es correcto, desciende la tasa de muerte y aumenta el número mutaciones en el genoma bacteriano. Muchos microorganismos tienen enzimas reparadoras que reparan el daño inducido en el DNA por la radiación ultravioleta.
Radiación Infrarroja:
Las ondas infrarrojas poseen poco poder de penetración y al parecer no matan a los microorganismos directamente. Sin embargo, la absorción de tales radiaciones da como resultado un incremento en la temperatura, exponiendo los microorganismos a temperaturas más elevadas que sus temperaturas óptimas de crecimiento.