Duplicación »in vitro»:
El estudio in vitro de la duplicación del ADN fue posible gracias al aislamiento de la enzima
ADN-
polimerasa por
Kornberg
. Esta enzima es incapaz de iniciar una cadena de novo
; requiere la presencia de un extremo libre del carbono 3′ de un nucleótido, para poder ir añadiendo los nucleótidos nuevos. Este extremo 3′ libre lo aporta el cebador o «primer», que es una porción pequeña de nucleótidos complementaria al extremo de la cadena patrón. Por tanto, la cadena naciente siempre crecerá en el sentido 5′->3′. El primer nucleótido de la cadena nueva tiene un extremo 5′ libre; se irán añadiendo nucleótidos a los extremos 3′ libre y se irán formando los enlaces fosfodiester 3′->5′, de forma que el último nucleótido tendrá libre el carbono 3′.Los nucleótidos se añadirán siguiendo las reglas de la complementariedad de bases, de manera que la nueva hebra sintetizada será antiparalela y complementaria a la patrón.
Duplicación »in vivo»:
Cairns (1963): Realizó la duplicación de DNA de E.Coli poniendo en el medio timina marcada con tritio(H3)(emite radiación beta que impresiona placa autorradiografica) Cada 2′-3′ se extraían bacterias del cultivo y se impresionaba una placa autorradiografica, parecía que la DNA polimerasa sintetizaba sin cebador y el crecimiento de las hebras era bidireccional lo que mas tarde se soluciónó por
Okazaki que encontró fragmentos de mil a dos mil nucleótidos de ADN y unos cincuenta nucleótidos de ARN, que se añadían discontinuamente sobre la hebra patrón. A medida que se abría la horquilla de replicación se iniciaba la síntesis de un nuevo fragmento de Okazaki
. Una hebra de la horquilla se copiaba de forma continua en dirección 5′->
3′ y la otra lo hacía de forma discontinua, mediante los fragmentos de Okazaki, también dirección 5′->
3′. Los nucleótidos de ARN eran añadidos por la ARNpolimerasa, enzima que no precisa cebador, y luego la ADN-polimerasa iba incorporando los desoxinucleótidos, sobre la hebra patrón.
Mecanismo de duplicación en bacterias.Señal o secuencia de iniciación de la replicación
Secuencia de nucleotidos que indica el origen de la replicación.
Helicasa
Enzima que rompe los puentes de H entre las hebras complementarias.Empieza al reconocer la señal de iniciación.//EL desenrollamiento de las hebras genera superenrollamientos que son corregidos por 2 enzimas:
Topoisomerasa I
Corta y empalma hebras sencillas de DNA.
Toipomerasa II
Corta y empalma hebras dobles de DNA.//Una vez separadas las hebras, se asocian las proteínas SSB para impedir que vuelvan a unirse formándose:
la Horquilla de replicación estructura en V formada por las dos nuevas hebras de DNA sintetizadas sobre la doble cadena antigua que sirve de molde. Como el proceso es bidireccional se forma la burbuja de replicación formada por la uníón de dos horquillas.Tiene forma de media luna.
Una hebras es de crecimiento continuo la RNA polimerasa sintetiza el primer o cebador en dirección 5′->3′ ya que puede sintetizar »ex novo».Seguidamente la DNA polimerasa III(que no puede sintetizar »ex novo» engancha nucleotidos al primer RNA en dirección 5′->3′. La energía para el enlace es aportada por los nucleotidos trifosfato que pierden un pirofosfato.
La otra hebras es de crecimiento discontinuo a unos 1000 nucleotidos de la señal de iniciación la RNA polimerasa sintetiza el primer cebrador en dirección 5′->3′(50 nucleotidos)
la DNA polimerasa III engancha unos 1000 nucleotidos al primer de RNA en dirección 5′>3′ (fragmentos de okazaki).
Estos pasos se repiten varias veces. Después la DNA polimerasa I (con función exonucleasa y polimerasa de huecos) retira los fragmentos de RNA y rellena los huecos con desoxirribonucleotidos.Existe la DNA polimerasa II que es polimerasa de huecos, pero no exonucleasa.
DNA ligasa une los fragmentos gastando ATP.
Mecanismo de duplicación en eucariotas, proceso similar a lo que ocurre en bacterias.
1 señales o secuencias de iniciación secuencia de nucleotidos que indica el origen de la replicación.Existen 100/cromosoma.
2Helicasa enzima que rompe los puentes de H entre las hebras complementarias.Empieza al reconocer las señales de iniciación.
3El desenrrollamiento de las hebras genera superenrollamientos que son corregidos por 2 enzimas:
Topoisomerasa I:
corta y emplama hebras sencillas de DNA.
Toipomerasa II
Corta y empalma hebras dobles de DNA
.4
una vez separadas las hebras se asocian las histonas para impedir que vuelvan a unirse, formándose la horquilla de repliacion.Las histonas viejas se unen a la hebra continua y las de nueva síntesis a la hebra retardada
.5Como el proceso es bidireccional se forman las burbujas de repliacion a lo largo de los cromosomas. Su distribución es irregular, pero se activan coordinadamente repliciones.
6Una hebra es de crecimiento continuo cuando la RNA polimerasa sintetiza el primer o cebador en dirección 5’3′ ya que puede sintetizar »ex novo» y cuando la DNA polimerasa δ (no sintetiza ex novo) engancha nucleotidos al primer RNA en dirección 5’3′.La energía para el enlace es aportada por los nuecleotidos trifosfato que se hidrolizan y pierden un pirofosfato.
7La otr hebra es de crecimiento discontinuo a unos 1000 nucleotidos la señal de iniciación la primasa sintetiza un primer RNA(50 nucleotidos) en dirección 5’3′ la DNA polimerasa α sintetiza un fragmento de DNA de unos 100-150 nucleotidos fragmentos de okazaki mas pequeños que en procariotas. Después la RNAsa H elimina los fragmentos de RNA y la DNA polimerasa δ rellena los huecos con desoxirribonucleotidos.Por ultimo, la ligasa une los fragmentos.
8 la velocidad de síntesis en eucariotas es menor que en procariotas porque existe correcion de galeradas por parte de la DNA polimerasa δ y los fragmentos de Okazaki son mas pequeños
.9-La replicación se produce durante el periodo S de la interfase y dura unas 6-8 horas.