Citometría de Flujo: Principios y Técnicas

Suspensión y Preparación de Muestras

Las suspensiones celulares de sangre deben estar debidamente identificadas con datos del paciente, recuento celular diferencial y resultados de frotis y citoquímica. Se añade EDTA K3 como anticoagulante para evitar la adhesión plaquetaria y conservar la morfología celular. La muestra debe ser una suspensión monodispersa representativa que preserve las características celulares.

Dilución y Lisis

Se diluye la muestra para obtener la concentración adecuada para la citometría de flujo. Se añade un tampón de lisis de glóbulos rojos para eliminar eritrocitos.

Centrifugación y Lavado

Se centrifuga la muestra para separar las células y eliminar el sobrenadante. Se lava nuevamente para eliminar los anticuerpos no unidos.

Marcado de Células

Se marcan las células con anticuerpos específicos conjugados con fluorocromos para detectar las moléculas de interés. Se incuban y lavan nuevamente para eliminar los anticuerpos no unidos.

Detección

Los detectores son fotomultiplicadores (SSC) y fotodetectores (FSC y fluorescencia).

Análisis de Datos

Los datos generados se presentan como citogramas o histogramas en ejes X/Y. Pueden representar una sola variable (por ejemplo, tamaño celular) o gráficos de dos o tres dimensiones.

Aplicaciones en Diagnóstico

Tumores

• Diferenciación antigénica
• Detección de enfermedad mínima residual

Leucemias y Linfomas

• Diagnóstico y clasificación

Inmunodeficiencias Primarias

• Diagnóstico y clasificación

Enfermedades Autoinmunes

• Monitorización

Cuantificación de Células

• Linfocitos CD4+ y CD8+ en sangre periférica
• ADN y ARN

Técnicas Complementarias

Ficoll-Hypaque

Técnica de centrifugación por gradiente de densidad para obtener células mononucleares de sangre periférica.

Estimulación de Linfocitos con Mitógenos

• Ensayo de linfoproliferación: mide la respuesta celular y la exposición previa a microorganismos.
• Reacción linfocitaria mixta: determina la histocompatibilidad en trasplantes.

Incorporación de Timidina Triada

Marca radiactivamente el cultivo celular para medir la estimulación blástica.

Nitroblue Tetrazolium (NBT)

Cuantifica la activación del metabolismo celular de los fagocitos.

Pruebas de Actividad Fagocítica

• Capacidad bactericida
• Prueba de reducción de nitroblue tetrazolium