Las técnicas de hibridación en soporte sólido se caracteriza xq una de las dos moléculas implicadas, la secuencia diana o la sonda, se inmovilizan sobre un soporte sólido previo a la hibridación.Lo habitual es fijar al soporte la secuencia diana e incubar posteriormente con la sonda marcada xa formar un hibrido.En otras ocasiones se obtiene más infomacion fijando al soporte la sonda e incubando con el ácido nucleico, previamente marcado. En las técnicas de hibridación en medio liquido, el hibrido sonda/secuencia diana se forma en solución, en ls pocillos de una placa microtiter y posteriormente se fija a la pared del pocillo xa proceder a su detección.No se marca ni la sonda ni la muestra.
El hibrido de detecta x métodos indirectos, xa el diagnóstico microobiolog y xa la detección de virus.Permiten analizar múltiples muestras a la vez y fácilmente automatizables.Las + importantes son la técnica de captura de hibrido y la técnica de ADN ramificado. Las técnicas de hibridación in situ son técnicas de hibridación d los ácidos nucleicos se realiza directamente sobre extensiones citologicas o secciones de tejido y el resultado obtenido se analiza microscopicmente en el contexto de detalles morfológicos.Dependiendo del marcadr se utilizan 2 tipos de ISH: –
hibridación in situ fluorescente (FISH):Se marcan con fluorocromos(con un microscpio de fluorescencia)-Hibridación in situ cromogénica(CISH)Las sondas se marcan con aptenos, sedetectan con x métodos inmunohistoquimicos,se visualiza con un microscopio normal. –el dot blot es una técnica de hibridación q utiliza membranas de nitrocelulosa o nailon como soporte solido y permite detectar secuencias de ácidos nucleicos, ADN o ARN en una mezcla compleja, sin aportar ninguna información adicional.La +simple, sobre las membranas se coloca una gota d la muestra ,q puede ser un ácido nucleico purificado, un lisado celular, un producto d amplificación x PCR.Permite el estudio simultaneo d varias muestras con sondas radiactivas o sondas marcadas con aptenos. Si las aplicaciones se relizan en forma de banda en vez d circular se denomina Slot Blot.Se realiza incubandolas membranas con los reativos x inmersión en cubetas, en bolsas de plástico termosellables o cn cierre hermético o en frascos con tapón d rosca.

Protocolo: 1. Aplicación de la muestra al soporte

Hay q humedecer la membrana mediante inversión durante 10 min en un tampón adecuado o agua destilada.Después se saca del liquido húmedo y se retira el exceso colocando la membrana entre dos hojas de papel de filtro y se ensambla en el sistema de vacío xa q tenga una adecuada fijación de la muestra ala membrana. Esto consta de una plantilla con pocillos,debajo la membrana de nitrocelulosa o nailon humedecida y una junta selladora(xa evitar la contaminación d la muestra)Todo esto se sitúa sobre una cámara colectora q va conectada al vacío.Aplicaciones de muestras de ADN 1 Debe ser desnaturalizadas antes d su aplicación a la membrana.Se incuban con hidróxido sódico a 100º durante 10 mint.2. Se renaturalizan con un volumen igual de acetato d amonio. 3. Se cargan en las posiciones correspondientes de la plantilla y se aplica el vacío.Queda retenido en la membrana,mientras q todos los reactivos se filtran ala cámara colectora.4.Pueden ser lavads cargando el pocillo hidróxido sódico.5. Se desmonta el sist de vacío, se lava la membrana con SSCy se seca en estufas a 80ºC xa unir el ADN a la membrana, pudiendo ser ancladas definitivamente a estas membranas con luz ultravioleta.(x el esqueleto d azúcar fosfato x lo q las bases nitrogenadas quedan libres xa poder hibridar cn la sonda)Aplicación de muestra de ARN:Xa evitar la formacón d horquillas intracatenarias q dificultan la hibridación hay d desnaturalizar la muestra de ARN, el tratamiento es + suave con sosa y edta.2.El lavado se realiza cn la misma solución.3.Una vez extraída la membrana del sist de vacío, se lava con SSC.Las membranas de nitrocelulosa se secan a 80ºC y las de nailon con estufa o se irradian con UV

. 2.Prehibridacion

Se incuban cn una solución de prehibridacion xa blokear las posibles uniones inespecificas de la sonda ala membrana,xa q se pueda unir de manera especifica a la secuencia diana.Suelen ser la misma composición q la hibridación.Pueden llevar un ADN carrier( ADN de esperma de salmón)q va a blokear las uniones inespecficas d los ácidos nucleicos a la membrana.La membrana se incuba a la misma tº que con la hibridación 65-68ºCsino se utiliza formamida o 42º si se utiliza.

3.Hibridación

El ADN bicatenario se desnaturaliza calentándolo a 95-100ºC durante 5min y enfriamiento rápido en hielo.Se retira la prehibridacion del contenedor y se sustituye x un volumen igual a de solución fresca a la q se añade una sonda recién desnaturalizada.La membrana se incuba a la tº adecuada, en agitación(4-24h).

4.Lavado de poshibridación

Si las 2 fases anteriores se han hecho en bolsa,se saca la membrana y se coloca en una cubeta xa proceder a los lavados d poshibr en agitación.Se hacen 2 o 3 lavados disminuyendo la fuerza ionica o aumentando la tº del lavado.

5.Detención del hibrido

Según el tipo d marcaje.-Marcado radiactivo:La sonda empleada esta marcada radiactivamente, finalizado el lavado de poshibridacion, la membrana se puede secar y se releva mediante exposición autorradiografía, colocando una placa radiográfica encima y dejándola en oscuridad durante horas o días.Al revelar la placa aparecerán unos puntos negros, aquellos q contenían la seciencia diana.Si se va a usar xa una segunda hibridación no se debe secar(se envuelve en plástico xa mantenerla húmeda y evitar el contacto con la placa fotográfica)-Marcado con haptenos:Si esta marcada con haptenos, se revela con un método de detección cromogenico.El resultado final es una mancha coloreada en las posiciones correspondientes a las muestras positivas.(No pueden usarse xa una segunda hibridación)

6.Rehibridacion:

(solo en caso de marcaje radiactivo)La membrana se somete a 2 lavados d 20 min cada uno cn una solución de baja fuerza ionica a una tº de 95ºC Aplicaciones de dotblot:
Como técnicas de rastreo: Se puede utilizar como técnicas de rastreo o xa detectar secuencias d interés, algunos ejempls:-estudios de expresión génica, xa detectar ARNm concrets en poblaciones celulars –Detección de secuencias extranas en muestras biologics(xa detectar la presencia d virus,bacterias o parásitos)-Control d calidad d PCR xa comprobar la especificidad d ls productos amplificados.Mejora también en algunos casos la sensibilidad de la PCR sola.-Control de calidad del marcaje de sondas, utilizando secuencias diana control.Colocando en la membrana diluciones seriadas de control, permite calcular la sensibilidad y el limite de detección de la sonda marcada.-Determinación del sexo en especies sin diferencias fenotipicas.Aplicaciones especificas:

Aso dot blot:

Para detectar mutaciones tanto en homocigosis y heterocigosis mediante el empleo de oligonucleotidos específicos de alelo,ASO.Xa detectar mutaciones asociadas con enfermedad, siempre y cuando el nº de posiciones variantes alélicas relevantes sea reducido.Es necesario hacer una PCR xa amplificar la región del gen q presentan variaciones alélicas.La PCR se utiliza como muestra en un dot blot xa hibridar como oligonucleotidos específicos del alelo normal (no mutado) y de una variante alélicas.

Dot blot inverso:

El mismo fundamento q el ASO, pero aplica una estrategia inversa.Lo q se inmoviliza en la membrana son los distintos oligonucleotidos específicos del de alelo(normales y mutados) sin marcar, lo q permite estudiar genes con un gran numero de variantes alélicas q afectan a distintas zonas de gen.Se marca el producto de la PCR q amplifica el gen d interés utilizando nucleotidos marcados en la PCR, usando cebadores marcados, también permite distingur individuos homocigots y heterocigotos.Ejm: talasemias, en ls q se han descrito múltiples mutaciones capaces d causar patologías.

Hibridación de colonias:

xa detectar bacterias q portan una secuencia genética concreta, un gen de interés, un plasmido natural o plasmido recombinante.La diferencia de dot blot esta en la forma d aplicar la muestra.De una placa de tej crecida, con colonias d bacterias aisladas, se recorta una membrana xa dot blot de tamañ d una placa petri y se coloca sobre las bact xa q se pegen las colonias.Después se lisan las bacterias y se desnaturaliza el ADN, colocando una membrana sobre papeles secantes empapados en soluciones(SDS 10% fijo y NaOH 0´5N desnaturalizante).Se fijan el ADN al soporte mediante calor o UV y se continua como en dotblot.Se obtiene una manxa oscura en posición de la membrana q contacto con una colonia q portaba la sec diana, permitiendo su localización en la placa d cultivo d partida.

Hibridación en placas virales:

Detectan virus q portan la secuencia diana, útil xa localizar los fagos recombimnants q contienen la secuencia clonada.Parecido a la hibridicion d colonias, se replica sobre la membrana d dot blot es la distribución d placas virales d lisis producidas sobre un césped de bacterias crecido en una placa d cultivo.( si no hay lisis no hay virus.Si muere la bacteria hay virus,Si hay círculos hay virus d lisis)El Southern blot es una técnica d hibridación q permite identificar fragmentos de ADN separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa o nailon.Permite la detección simultanea de varias secuencias diana de distintos tamaños con una única hibridación.Se utilizan sondas radiactivas, aunq pueden emplearse otros marcajes.

Protocolo:

Es ADN purificado, sometido a un proceso de digestión enzimática,electroforesis en gel, transferida a membrana ,hibridación y revelado.

1

Digestión enzimática:Con una o varias enzimas de restricción.(su objetivo es trocear el ADN de partida enfragmentos diferentes d tamños, esto aporta información sobre el tamaño del fragmento.El protocolo varia según la enzima empleada y del ADN de partida:-Con ADN genomico:digerimos toda la noche con un exceso de encima.-plasmido clonado:1º 2 horas

.2

Electroforesis en gel:El ADN digerido se somete a una electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida xa separar los fragmentos producidos según su tamañ.En el gel se puede incorporar un agente intercalante fluorescente como el bromuro de etidio(permite fotografiarlo después d terminar la electrofres iluminándolo cn luz UV mediant un transiluminador)También se puede teñir el gel con el agent intercalant después d la electroforesis y después obtener la fotografía.Esta fotografía permitiera comparar el patrón de bandas de ADN después d la digestión con el resultado d la hibridación.Con ADn genomico,tras la electroforesis s observa una estela fluorescente con smear.Con plasmidos se observan patrones con un numero reducido d bandas.
3.Transferencia de ADN a la membrana:Se obtiene una replicaa exacta del patrón de bandas de ADN en el gel sobre una membrana d nitrocelulosa o nailon: 1Desnaturalilacion:Antes d tranferir los fragmentos de ADn del gel a la membrana hay q separar las cadenas de ADN xa q se puedan hibridarconsta de tres pasos:1.1Desnaturalizacion alcalina con una solución de hidróxido sódico. 1.2Neutralizacion con un tampón a PH neutro.1.3 Lavado del gel con solución d lavado(ejm solución salina fosfato con EDTA) 2.Tranferencia:Transferir el ADN desnaturalizado desde el gel a la membrana es por capilaridad.Los elementos son:Cubeta con buffer d Transf.,Un soporte d plastc,papel d filtro humedecido con buffer d Transf y sus extremos sumerg en el buffer d la cubet,el gel colocado abajo,la membrana de nitrocelulosa o nailon humedecida,3hojas d papel d filtro,una pila d papeles absorvents y un peso.3.Anclaje del ADN a la membrana:Incubando la membrana a la estufa a 80ºC o irradiando con luz UV ls menbranas d nailon.

4

Hibridación:Incubando la membrana cn distintos reactivos dentro de una bolsa, con cierre hermético.Todas ls incubaciones tº adecuada y con agitación.Previa a la hibridación cn la sonda especifica la membrana se incuba con una solución d prehibridacion q contiene ADN con esperma d salmón desnaturalizado(xa evitar uniones inespecificas d la sonda a la membrana)La hibridación s realiza con la sonda o sondas marcadas y diluidas en una solución d hibridación adecuada.Finalmente se realizan 2 o mas lavados de poshibridacion en condiciones de rigurosidad creciente según interesen.

5

Revelado:Mediante autorradiografía con una película de rayos X(aparece una mancha oscura y los puntos de la membrana, se localizan los híbridos sonda secuencia/diana)La comparación del patrón de bandas observado tras la electroforesis con el resultado d la hibri, posibilita la identificación d secuencias diana.

Aplicaciones de Southern blot:

La elaboración de huellas genéticas.-El estudio de mutaciones estructurales (trasloc,deleciones,inserciones ,inversiones)-La detección de secuencias adquiridas.

Northern blot(ARN)

Técnica de hibridación q permite detectar moléculas d ARN separadas x electroforesis en gel y tranferidas a una membrana de nitrocelulosa o nailon.

Protocolo de Northern blot:

Muy parecida a Southern blot xo con 3 diferencias:-No se requiere digestión enzimática-Electroforeris en condiciones desnaturalizantes.Las moléculas en solución tienden a adquirir complejas estruccturas secundarias(dificulta su migración en ls geles)para evitarlo se emplean geles de agarosa con formaldehído(se diluye un tampón con formadina y formaldehído y se calienta a 65ºC xa desnaturalizarlo)-No es necesario el paso de desnaturalización antes de la tranferencia del gel a la membrana.

Aplicaciones d North:-

Análisis de explresion génica, la detección de mutaciones, estudios de corte y empalme o splicing alternativos.

Microarrays:

De ADN son conjuntos o colecciones de fragmentos de ADN(sondas) distintos fijados a una superficie solida(vidrio ,plástico o silicio).Partiendo d una muestra y realizando la hibridación , un microarray detecta simultáneamente miles d secuencias distintas, cualitativa y cuantitativamente.Son potentes herramientas xa estudios genomicos y de expresión génica.Ls sondas ancladas en el biochip son monocatenarias y no están marcadas,se marca con fluorocromos la muestra q se va a estudiar, su lectura requiere un escáner d lectura láser y un potente sofware de análisis.

Fabricación de microarrays:

2 estrategias:-depositar las sondas una a una en el soporte solido,se utilizan fragmentos de ADNc, oligonucleotidos sintéticos específicos o productos d amplificación x PCR con un primer.El deposito d las sondas se realiza con un brazo robotiado q deposita microgotas, el resultafo final es una matriz de puntos sobre el soporte,formado x cientos de miles d moléculas ,permite fabricar microarrays con decenas de miles de puntos (sondas) microscópicos en una superficie de 2-3cm2.-Sintetizar las sondas sobre la propia superficie solida, las sondas son peqñ oligonucleotidos q se sintetizan in situ en la superficie solida ,mediante técnicas fotolitograficas o electroquimicas, permite fabricar matrices con cientos de miles de sondas en una superf de 1-2cm2.

Protocolo de trabajo genérico:

1. Marcaje de la muestra.Se marcan con fluorocromos:-xa estudios de expresión génica:Prurificar ARNm y sintetizarADNc con nucleotidos marcados-xa estuddios genomicos se purifica ADN y se marca, mediante nick translation o random priming2 Hibridación y lavados de poshibridación.Si se a realizado con biotina, los lavados de poshibri se realixa un paso deextra de tinción se incuba el microaray con estreptavidina marcada con fluorocromo 3 Lectura del microarray: Un escáner con un láser q excita cada punto de la matriz con la longitud d onda adecuada al fluorocromo y un detector q mide la intensidad d la fluorescencia.4Analisis e interpretación de los resultados:Mediante un sofware especifico.

Aplicaciones de los microarrays: Hibridación genómica comparada en arrays:

Permite detectar e identificar alteraciones genéticas en perdoda o ganancia del material genetic,mediante comparación del ADN de la muestra con un ADN de referencia,Consiste en marcar el ADN de referencia con fluorocromos distintos(verde y rojo)La fluorescencia final va a depender de la proporción d ambos en la mezcla:rojos:deleciones en el ADN problema amarillos:genes inalterados verdososos:duplicaciones en el ADNproblemas.Para relizar estudios genómicos d células tumorales, en el diagnóstico d enfermedades genéticas y el diagnóstico prenataln pero no detecta alteraciones cromosomitas estructurales Estudios de expresión génica:
Alanilis detallados de perfiles de expresión génica.-en términos absolutos:hibridando microarrays con el ADNc obtenido del ARNm de una población celular.-en términos comparativos:hibridando con una mezcla de de ADNc de la muestra problema y un ADNc de referencia marcada con distintos fluorocromos. Los estudios de expresión génica comparada:
Permiten comparar la misma población celular en distintos estadios metabólicos o en distintas situaciones.

Otras aplicaciones de los microarrays:

Útiles para estudiar a gran escala todo tipo de polimorfismos y mutaciones,una gran repercusión en el diagnóstico,pronostico y evolución d enfermedads y la predisposición a padecerlas.

Técnica de captura del hibrido:

Se basa en la formación de híbridos ARN/ADN q serán reconociodos o capturados x anticuerpos específicos:1.Lisis de los virus y desnatralizacion del ADN Entubo ependorf mezclando los volúMenes adeuados y una solución alcalina desnatura2 Hibridación:Se mezclan las cantidades adecuadas y la sonda.3.Captura del hibrido:se traspasa a un pocillo de unaplaca microtitercon la pared recubierta de anticuerpos4. Detección del hibrido:Se añaden anticuerpos con fosfatasa alcalina 5. Revelado: Se añade un sustrato quimicoluminiscente y se detecta con un luminometro o lector d placas.

Tecnología del ADN ramificado

Consiste en un sistema de amplificación de señal, basado en la unión de secuencia diana a un macrocomplejo de ADN, de tipo arborescente, mediante sucesivas hibridaciones:1Lisis de las partículas víricas y desnaturalización: (en los virus ADN) 2Hibridación con sondas especificas:Dos tipos de sonda:Sondas para captura:La parte de la sonda en complementaria a la región del ácido nucleico vírico y otra es complementaria de un oligonucleotidode captura fijado a la pared de un pocillo de una placa microtiter.Sondas de extensión:Una parte de la sonda es complementaria al ácido nucleico vírico y la otra al extremo de un oligonucleotido.3.Captura del hibrido:Se traspasa a un pocillo de una placa microtiter recubiertas de oligonucleotidos de captura.4.Preamplificacion:Se añade preamplificador(tronco)5:Amplificación:Se ñaden amplificadores q se unen a sus extremos(ramas)6.Detección:Se añaden olignuc marcados con fosfatasa alcalina,se unen mediante hibridación(hojas)7. Revelado:Se añade sustrato quimioluminiscente detectable en luminometro o lector de placas.

ISH:tipos de muestras:

Se puede realizar sobre preparaciones citogeneticas de metafase o núcleos interfasicos desnudos,extensiones citologicas y secciones de tejido.
La hibridación in situ fluorescente se basa en el empleo de sondas marcadas con fluorocromos y visualizados en microscopios de fluorescencia con los filtros adecuados.Su principal aplicación es la detección de alteraciones cromosomitas tanto numéricas como estructurales.hibridación(en el porta exo 5 microlitos de la sonda marcada y se coloca en una placa calefactora a 72º 4-5 mint xa desnaturalizar y se coloca en una cámara húmeda a 37-42º durante 12-16 h),,lavado poshibridacion(inversión en soluciones d lavado en coplin), contratincion (se elimina el exceso de solución y se ponen vertical y se dispersan 5.7microlit de contratincion(duiamino –fenil-indol=DAPIcon fluorescencia azul) y visualización.

FISH interfasica:

consiste en la detección de secuencias de ADN en núcleos en interfase, bien bien sobre preparaciones citogeneticas de núcleos desnudos, bien en extensiones citologicas o secciones de tejido//