Biotecnología

Desde hace miles de años, la humanidad ha utilizado los procesos de fermentación microbiana para obtener productos útiles. La biotecnología moderna implica la manipulación deliberada de material genético de los organismos vivos con el fin de fabricar o modificar un producto, mejorar animales o plantas o desarrollar microorganismos con capacidades determinadas para usos específicos. El proceso de la biotecnología moderna ha permitido conocer los mecanismos que regulan la decodificación y la expresión de la información contenida en los genes y el desarrollo de una serie de herramientas y técnicas precisas como por ejemplo:

• Tecnología del ADN recombinante
• Técnicas de ingeniería genética
• Técnicas de clonación celular
• Técnicas de cultivo de células y tejidos.

Tecnología del ADN Recombinante

La tecnología del ADN recombinante comprende una serie de técnicas que permiten manipular el ADN, es decir, cortar, aislar, pegar, reproducir y secuenciar fragmentos específicos del ADN de cualquier organismo. Además, incluye técnicas con las que se puede insertar un fragmento de ADN que proviene de un organismo donante en otra molécula de ADN, llamada vector. Después se obtiene una molécula de ADN con una nueva combinación. El ADN recombinante es cualquier molécula de ADN formada por la unión de segmentos de ADN de origen diferente.

Enzimas Celulares

En las células vivas, el ADN es cortado y vuelto a unir una y otra vez por enzimas, un tipo de proteínas que han sido identificadas y purificadas por los científicos para usarlas en los laboratorios.

• Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción son sintetizadas por las bacterias para proteger su ADN de un ADN invasor. Funcionan como unas tijeras químicas que cortan el ADN extraño en fragmentos.
• Las ligasas son enzimas que unen distintos fragmentos de ADN pegando sus extremos.

Análisis de Fragmentos de ADN

Una vez que las enzimas de restricción han cortado un trozo de ADN, los fragmentos se pueden separar y analizar mediante diferentes técnicas como, por ejemplo, la electroforesis en gel de agarosa:

La electroforesis en gel de agarosa separa los fragmentos de ADN en función de su tamaño y carga eléctrica. El soporte que se utiliza para que el ADN se pueda mover es la agarosa, un polisacárido parecido a la gelatina. El procedimiento para realizar una electroforesis en gel de agarosa es el siguiente:

• Se prepara una lámina delgada de agarosa gelificada en un molde que permite la formación de una hilera de pequeños huecos denominados pocillos para muestra. La lámina se introduce en una cubeta de electroforesis que contiene una solución de agua y sales y que posee electrodos adheridos a cada extremo.
• En cada pocillo del gel se carga con una micropipeta una muestra diferente que contiene la mezcla de ADN de distinto tamaño que se desea separar.
• Como el ADN está cargado negativamente, cuando se aplica la corriente eléctrica los fragmentos avanzan por el gel al electrodo positivo. Los fragmentos más pequeños cruzan la malla formada por el gel más deprisa y más fácilmente.
• Después de un tiempo, la corriente se interrumpe. Para visualizar el patrón de bandas de ADN, la lámina de agarosa se tiñe con bromuro de etidio que, cuando se halla unido al ADN, emite fluorescencia bajo luz ultravioleta.

La electroforesis en gel de agarosa separa una mezcla de moléculas de ADN en bandas, cada una de ellas formada por miles de moléculas de ADN en la misma longitud. Esta técnica permite obtener la huella génica (patrón de bandas característico y exclusivo del ADN de cualquier organismo). La huella génica constituye la huella digital del ADN y hace posible averiguar la identidad de un individuo, por ejemplo, en un delito, paternidad, antiguos misterios.

Hibridación Mediante Sondas de ADN: Búsqueda Específica de un Gen

La hibridación es el proceso en el que dos hebras de ADN de cadena sencilla con una secuencia de bases complementaria se unen para originar una molécula de ADN de cadena doble correctamente apareada. Es una técnica fundamental para la biotecnología porque permite identificar la presencia de un gen que codifica una proteína de interés en un cromosoma. Para ello, lo que se hace es un ensayo de hibridación con una sonda de ADN. Una sonda de ADN es un fragmento artificial de ADN de cadena sencilla marcada con radiactividad o fluorescencia y cuya secuencia de nucleótidos es complementaria a la secuencia del gen que se desea detectar.

Cuando se quieren analizar simultáneamente miles de genes se utilizan biochips o chips de ADN. Los biochips son láminas de vidrio donde se fija en cada una de sus microscópicas celdillas una cantidad ínfima de fragmentos de ADN de cadena simple cuya secuencia de nucleótidos actúa como sonda para un gen determinado. Las miles de microscópicas celdillas se sitúan en forma de cuadrícula en la lámina de vidrio y permiten desarrollar en paralelo miles de reacciones de hibridación. Como se conoce la situación de cada sonda, cualquier fragmento de ADN que hibride podrá ser identificado. La tecnología de los biochips se utiliza para:

• Detectar mutaciones
• Controlar la expresión de los genes
• Diagnosticar enfermedades infecciosas
• Personalizar el tratamiento con medicamentos
• Sugerir nuevas terapias

Clonación del ADN

Clonación significa producción de ejemplares genéticamente idénticos mediante reproducción asexual. La clonación de un fragmento de ADN consiste en la obtención de miles de millones de copias idénticas de dicho fragmento. Para clonar un fragmento de ADN, este debe ser introducido en un vector de clonación que es una molécula de ADN pequeña capaz de entrar en una bacteria y de autoreplicarse dentro de ella. Los vectores más utilizados son los plásmidos bacterianos.

El método de clonación es el siguiente:

1. El plásmido y el ADN que se quiere clonar se cortan con la misma enzima de restricción. Con los plásmidos y los fragmentos de ADN se obtienen plásmidos recombinantes que se incuban con un cultivo de bacterias en las condiciones adecuadas para que cada una de ellas incorpore solo un plásmido recombinante. Este proceso se denomina transformación.
2. Como los plásmidos llevan un gen que les confiere resistencia a un antibiótico, las bacterias transformadas pueden ser seleccionadas colocándolas en placas de cultivo. Únicamente las bacterias que llevan el plásmido recombinante serán resistentes, las demás mueren.
3. Cada colonia de bacterias transformadas se aisla y se mantiene en crecimiento. A medida que las bacterias se duplican, también se duplican los plásmidos y los fragmentos de ADN que llevan insertados. La colección de clones de ADN obtenida a partir de un ADN de interés se denomina biblioteca o genoteca de ADN.

Amplificación del ADN: Reacción en Cadena de la Polimerasa

El ADN se puede amplificar en el interior de un tubo de ensayo sin clonarlo. La técnica se basa en un procedimiento llamado reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR es una reacción en cadena que origina millones de copias de un segmento específico de ADN mediante la repetición de múltiples ciclos de replicación del ADN in vitro. El material de partida es el ADN muestra que se desea copiar, una cantidad suficiente de los 4 nucleótidos, dos moléculas cortas de ADN de cadena simple o cebadores y una ADN polimerasa resistente al calor. La PCR es una herramienta utilizada para amplificar segmentos de ADN a partir de una extensa diversidad de fuentes con el fin de realizar un diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas.

Secuenciación del ADN

La determinación de la secuencia de nucleótidos es una parte fundamental de la información sobre cualquier fragmento de ADN. Existen técnicas automatizadas e informatizadas que permiten una secuenciación sencilla y rápida.