Preparación de Muestras para Citometría de Flujo

¿Cómo deben ser preparadas las suspensiones celulares, procedentes de sangre para ser analizadas por citometría de flujo?

1. Las suspensiones celulares procedentes de sangre deberán ir debidamente identificadas, indicando los datos del paciente, la presunción diagnóstica, el recuento celular diferencial y los resultados de los frotis y de la citoquímica realizada. Es fundamental que la muestra se encuentre en forma de suspensión monodispersa.
2. Una vez extraída la muestra de sangre, se le añade el anticoagulante EDTA K3, el cual evita la adhesión plaquetaria, conserva bien la morfología de las células y permite el recuento celular automático. Es fundamental que la muestra se encuentre en forma de suspensión monodispersa, además de que sea una muestra representativa que preserve las características celulares.
3. Ya con el anticoagulante, se realiza una dilución de la muestra para que adquiera la concentración adecuada para realizar la citometría de flujo, además de añadir un tampón de lisis de glóbulos rojos para eliminar eritrocitos.
4. Lavar y centrifugar la muestra para separar las células y eliminar el sobrenadante.
5. Marcar las células con anticuerpos específicos conjugados con fluorocromos para detectar las moléculas de interés, incubar y lavar nuevamente para eliminar los anticuerpos no unidos.
6. Para asegurar la viabilidad de las muestras debemos trabajar siempre a 4°C, tratar las células con mucha delicadeza para perder el menor porcentaje y filtrar las muestras en filtros de 30 micras justo antes de pasar por el citómetro.

Marcadores Celulares en Citometría de Flujo

Indique cómo se marcan la moléculas que expresan las células de interés en citometría de flujo

En citometría de flujo, las moléculas expresadas en células de interés se marcan utilizando anticuerpos conjugados con fluorocromos específicos. Estos anticuerpos se unen a las moléculas de interés en la superficie celular, y la señal fluorescente resultante se detecta y cuantifica mediante un citómetro de flujo.

Detectores en Citometría de Flujo

Cuales son los detectores del Citometría de flujo

Los detectores son de dos tipos:

• Fotomultiplicadores: para la detección de señales SSC (Side Scatter).
• Fotodetectores: para la detección de señales FSC (Forward Scatter) y fluorescencia.

Mantenimiento del Citómetro de Flujo

Indique el mantenimiento del citómetro de flujo que se debe pasar para obtener resultados fiables

1. Calibración: Calibrar el aparato empleando un estándar o patrón de normalidad.
2. Alineación: Utilizar estándares de alineamiento para detectar cambios o problemas en la configuración óptica y en el sistema de señales.
3. Ensayos específicos: Antes de implementar una técnica, realizar ensayos específicos para evitar errores e interferencias.
4. Controles de fluorocromos: Preparar tubos con los distintos fluorocromos por separado y otro con todos juntos, además de un control negativo compuesto por células sin marcaje.
5. Control de especificidad: Controlar la especificidad del anticuerpo conjugado empleando controles isotipo.
6. Titulación de anticuerpos: Titular el anticuerpo para determinar la concentración más adecuada.
7. Control positivo: Utilizar un control positivo para asegurar que los resultados negativos de la muestra no se deben a un fallo.
8. Limpieza: Realizar una limpieza regular del aparato.

Presentación de Datos en Citometría de Flujo

Cómo se expresan los datos necesarios en citometría de flujo

Los datos generados por los citómetros de flujo se llaman citogramas o histogramas, y generalmente se presentan sobre un eje de coordenadas X/Y. La información obtenida se representa de manera estadística en forma de porcentaje de células que cumplen algún criterio. Se pueden dibujar en relación a una sola variable o también pueden ser gráficos de dos o tres dimensiones.

Aplicaciones de la Citometría de Flujo

• Contribución al diagnóstico de tumores por diferenciación antigénica.
• Detección de la enfermedad mínima residual.
• Diagnóstico de leucemias y linfomas.
• Diagnóstico y clasificación de las inmunodeficiencias primarias.
• Monitorización de enfermedades autoinmunes.
• Cuantificación en sangre periférica de los linfocitos CD4+ y CD8+.
• Cuantificar el ADN.
• Cuantificar el ARN.
• Realizar el cariotipo de flujo.

Separación de Linfocitos por Ficoll

En que se basa la separación de linfocitos por Ficoll?

La técnica de Ficoll-Hypaque es una técnica de centrifugación por gradiente de densidad. Se basa en la centrifugación sobre una solución de densidad definida como la de Ficoll-Hypaque, que permite que se hundan los eritrocitos y los granulocitos (debido a su mayor densidad) y que floten las células mononucleares (linfocitos y monocitos); por ello, tras la centrifugación podremos obtener las células mononucleares de sangre periférica para nuestro estudio.

Estimulación de Linfocitos con Mitógenos

La estimulación de linfocitos con mitógenos se utiliza para activar y provocar la proliferación de linfocitos de manera no específica. Esto es útil en investigaciones o pruebas de laboratorio para estimular la división celular y la producción de citoquinas, proporcionando información sobre la funcionalidad y la capacidad de proliferación de los linfocitos en condiciones no específicas. Hay dos ensayos fundamentales:

1. Ensayo de linfoproliferación o estimulación blástica: Se usa para medir el estado global de la respuesta celular y diagnosticar la exposición previa a un microorganismo intracelular (vacunación o infección natural).
2. Reacción linfocitaria mixta: Se usa para determinar la histocompatibilidad en trasplantes.

Compuesto Químico para Cuantificar la Activación Metabólica

Compuesto químico soluble de color amarillo en estado oxidado, cuantifica la activación del metabolismo celular de los fagocitos. El estallido respiratorio o explosión es el proceso por el que algunas células son capaces de producir y liberar especies reactivas de oxígeno, como los radicales libres y el superóxido y peróxido de hidrógeno. Se caracteriza por un aumento muy violento en la demanda de oxígeno y en el consumo de energía a nivel celular.

Nota: Este último párrafo parece describir un concepto diferente y no está claro a qué se refiere. Se recomienda proporcionar más contexto o aclaraciones.