5/reacción en cadena de la polimerasa:
se usa cuendo la muestra de adn es muy escasa. La pcr permite amplificar una muestra muy pequeña de adn. Proceso de amplificación de adn mediante la pcr(cuadro): se necesita una muestra de adn, una pequeña secuencia de nucleotidos, una fuente de calor, adn polimerada resistente al calor y una cantidad adecuada de nucleotidos para formar las nuevas hebras de adn.
3 etapas:
1/desnaturalización: se calientas los productos y el adn se desnaturaliza y cada una de las cadenas sirven de molde para hacer la complementaria. 2/hibridación: se enfría y los cebadores de unen por enlaces de H a los extremos de las hebras de adn. 3/extensión: se forman las nuevas hebras gracias a la taq-polimerasa, que va agregando nucleotidos. Al final del primer ciclo se obtienen 2 moléculas de adn que se someten a uno nuevo para obtener 4 que tras el tercer ciclo se convierten en 8, así sucesivamente.. Este proceso es automático y se puede conseguir rápido hasta 100000 millones de copias, cada ciclo dura unos 5 min.
6/secuenciación del adn:
uno de los métodos mas usado es el método de terminación de la cadena para la secuenciación del adn o método didesoxi de sanger.
Método didesoxi de sanger:
para la secuanciacion es necesario el fragmento de adn que se quiere secuenciar, un cebador, una adn polimerasa, los cuatro desoxirribonucleotidos y los cuatro didesoxirribonucleotidos. Se necesitan muchos fragmentos del adn, y hay que clonarlo hasta tener un gran numero. 1/se desnaturaliza el adn que se desea secuenciar y se obtienen cadenas simples. 2/ se mezclan todos los componentes de la reacción y se forman nuevas cadenas de adn. La síntesis comienza en el extremo 3′ del cebador y al final se obtiene una mezcla de cadenas de adn. 3/ se separan las cadenas marcadas cuando la mezcla atraviesa un gel de poliacrilamina en un tubo capilar. El color de la marca nos indica que nucleótido ocupa el extremo de la cadena de adn. 4/ se obtiene un espectograma con una impresora que nos da la secuencia de bases complementaria. Este método es muy útil y rápido. Para secuenciar todo el genoma humano ha sido necerario otras tecnologías.
la diversidad de los microorganismos:
2/métodos de estudio de los microorganismo
Medios de cultivo:
responden a los siguientes criterios: -según su composición existen medios complejos sin composición definida, o medios sintéticos de composición concreta. Necesitan la adición de C,N,P… -según su estado físico, son en general disoluciones de agua y nutrientes a los que se añade gelatina o el agar-agar para convertirlos en medios sólidos. -según su utilidad se distinguen: medios de enriquecimiento usados para enriquecer un medio cuando el crecimiento de los microorganismos es lento, medios de aislamiento que son sólidos con nutrientes que permiten el crecimiento selectivo de una especie microbiana, medios de diferenciación que son los que en cultivo mixto permiten diferenciar unas colonias de otras(contienen un sustrato especifico y un indicador).
Métodos de aislamiento:
se basanen una reducción progresiva del numero de microorganismos de la muestra inicial. Posteriormente los germenes obtenidos en un medio de cultivo se transfieren a otro. -aislamiento por agotamiento de asa en superficie. -aislamiento por dilución y siembra en profundidad. -aislamiento directo.
Métodos de esterilización:
consiste en la eliminación de todo microorganismo vivo de un medio de cultivo, de un alimento o del material de laboratorio. Métodos usados para la esterilización: -calor, se emplea el autoclave con T de 120º y que se deben mantener unos 20min. También el horno Pasteur a unos 200º. -filtración: se recurre a la filtración para separar microorganismos que quedan retenidos en los poros del filtro. -radiaciones: se utilizan radiaciones ultravioleta, rayos gamma y radiaciones ionizantes que alteran en general las moléculas de ácido nucleico de las células.
Métodos de identificación:
la identificación de los microorganismos de un cultivo requiere de: -los estudios de microscopia que permiten identificar por la forma. Las tinciones diferenciales permiten separar a las bacterias en dos grandes grupos, como son las gram positivas y las gram negativas. -los métodos bioquímicos que utilizan galerías de identificación en las que se alojan una serie de sustratos con sus indicadores. La muestra se hace reaccionar con todas y se produce un código de colores. -las técnicas de la biología molecular que se basan en el conocimiento de secuencias concretas del genoma de los microorganismos, que hibridan con sondas de adn.