Ingeniería Genética
Conjunto de técnicas, nacidas de la Genética Molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo, por ejemplo, introduciendo genes en él aunque sea de otra especie biológica, incluso la inserción de genes animales en plantas, para que produzca determinada proteína.
ADN Recombinante
Formado al intercalar un segmento de ADN extraño con determinado gen deseable, por ejemplo, el gen humano de la insulina, en un ADN celular receptor.
Etapas:
- Obtención de los RNAm de la insulina: A partir de células pancreáticas humanas rotas por ósmosis o criofracturación, se extraen todas sus enzimas, proteínas, ADN, etc. incluidos todos los RNAm que codifican la síntesis de insulina humana. Luego se separan y aíslan esos RNAm de la insulina por ultracentrifugación gracias a sus distintos pesos moleculares y formas características. Los RNAm escogidos deben ser los maduros.
- Obtención de un DNA bicatenario de la insulina: A partir de precursores y transcriptasas inversas obtenidas de virus y RNAm se obtiene primero un DNA de la insulina monocatenario y luego uno bicatenario usando una ADN polimerasa.
- Adición o inserción del DNA de la insulina en un plásmido bacteriano: Los plásmidos son pequeñas moléculas de ADN circular con un tamaño menor que el del cromosoma bacteriano, se replican con independencia ya que tienen su propio origen de replicación. Previamente se “cortan” los plásmidos utilizando un tipo de enzimas bacterianas conocidas como “enzimas de restricción” que pueden considerarse como «tijeras moleculares» ya que cada tipo reconoce una secuencia específica de nucleótidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN. Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restricción. Los extremos “pegajosos” están escalonados. También se debe “preparar” el DNA de la insulina añadiéndole una secuencia de nucleótidos en sus extremos que coinciden con los nucleótidos de la zona de corte del plásmido. Se trata luego con la misma enzima de restricción para obtener en la molécula de DNA con el gen de la insulina también “extremos pegajosos”.
Además del “origen de replicación”, los vectores de clonación (plásmidos en este caso) deben llevar otros genes denominados “marcadores”, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos que sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador. El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto. En este caso se utiliza el fenómeno de la “transformación”, que ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos: la célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma. En este caso se unirían por transformación los extremos “pegajosos” del ADN de la insulina con el ADN del plásmido cortado. Al final se conseguirá una población de bacterias de distintos tipos:- Sin plásmidos.
- Con plásmidos normales.
- Con plásmidos conteniendo el gen de la insulina.
- Búsqueda y clonación de la bacteria con el gen de la insulina: Una vez que se ha conseguido la población de bacterias transformadas el siguiente paso es poner a las bacterias en distintos medios de cultivo con determinados antibióticos para que se multipliquen y utilizando una técnica llamada “réplica de placas”. Consiste en poner las bacterias en distintas placas de cultivo donde hay por ejemplo ampicilina. Las bacterias con plásmidos conteniendo el gen de la insulina se identifican porque producen insulina y porque además sólo crecen en medios con ampicilina (las bacterias sin plásmidos mueren en cualquier tipo de cultivo con antibióticos y las que tienen plásmidos normales resisten ampicilina). A la vez que se reproducen las bacterias lo hace también el plásmido con el gen que interesa, el resultado es que se obtiene un clon de células que llevan todas ese gen de interés y que además producen insulina humana.
Secuenciación del ADN
-Otra técnica de Ingeniería Genética es la determinación de la secuencia de nucleót de 1ADN determinado. Se ha conseguido gracias a “enzi de restricción” bacterianas y a la posibilidad de obtener numerosas copias de un á. nucléico x clonación. Se pueden conseguir muchos fragm , de diversos tamaños y lo q se trata es de recomponer la moléc original como si se tratase de 1 puzzle. Así se han secuenciado genes, desde virus hasta el genoma humano. El método + usado para la secuenciación es el conocido como “técnica de terminación de cadena de Sanger”, la cual se ha perfeccionado conociéndose como la “técnica del didesoxi”. Se denomina así porque se utilizan didesoxirribonucleótidos , nucleót sin el grupo alcohol OH del carbono 3′. Como los nucleót se unen x este grupo OH del carbono 3′, hay q pensar q si durante la x2 semiconservativa del DNA se utiliza x azar un didesoxinucleótido será imposible q se una otro nucleót y la cadena terminará aquí, x no reconocer la DNA polimerasa dicho nucleótido. Para hacer la reacción de secuenciación se necesita: *Como «molde» se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN q se va a secuenciar.*Como «cebador» para iniciar la síntesis, se necesita un corto oligonucleót complementario del extremo de la cadena. *desoxinucleótidos normales de las cuatro bases:. *didesoxinucleótidos de 1 base en cada 1 de las 4 reacciones de secuenciación. Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización en el cebador, pero cesa el incorporarse un didesoxinucleótidoSe produce 1 conjunto de cadenas x2 cuyas longitudes dependen de la situación del didesoxinucleótido incorporado.
*reacción en cadena de la polimerasa PCR-Consiste en aumentar el nº de copias de una mínima cantidad de fragm de ADN en un tubo de ensayo de forma ilimitada. Pueden generarse millones de moléc idénticas, a partir de una moléc de ADN en unas horas.La reacción es muy sencilla, necesita cantidades de ADN muy pequeñas y sólo se precisa un tubo de ensayo, algunos reactivos, una fuente de calor y unas pequeñas cadena de nucleótidos que actúan como cebadores.La reacción es un proceso cíclico: *La moléc de ADN q va a copiarse se calienta para q se desnaturalice y se separe las dos hebras. *Cada 1 de las hebras es copiada x una ADN-polimerasa especial.*Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo x el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias. Estos ciclos se repiten hasta q se obtiene el nº de copias deseado. *La potencialidad de esta técnica es impresionante, a partir de una sola moléc de ADN, la PCR puede generar millones de moléc idénticas en una tarde.*El ADN puede proceder de una muestra de tejido de un hospital, de una gota de sangre o semen en la escena de un delito, o de un cerebro momificado.