Duplicación del ADN

Existen tres modelos principales que explican cómo podría ocurrir la duplicación del ADN:

• Conservativa: La molécula original permanece intacta y se crea una copia completamente nueva.
• Semiconservativa: La molécula de ADN se separa en dos hebras, cada una de las cuales sirve como molde para la síntesis de una nueva hebra complementaria.
• Dispersiva: La molécula de ADN se rompe en fragmentos, que luego se vuelven a unir para formar dos moléculas nuevas, cada una con una mezcla de ADN antiguo y nuevo.

Trabajo de Herbert Taylor

Objetivo

Determinar cómo se duplica el ADN.

Problema

¿Cuál de los tres modelos de duplicación del ADN es el correcto?

Materiales

• Raíz de Bellevalia
• Aminoácidos
• Timidina
• Tritio (isótopo radioactivo)
• ARN
• Enzimas
• ATP
• Placa radiográfica
• Microscopio

Procedimiento

1. Se cultivaron células de raíz de Bellevalia en un medio que contenía timidina marcada con tritio. La timidina es un nucleótido que se incorpora específicamente al ADN durante la replicación.
2. Después de un ciclo de replicación, se trataron las células con colchicina, una droga que detiene la división celular en la metafase al impedir la formación del huso mitótico, pero permite que los cromosomas se dupliquen.
3. Se observaron los cromosomas al microscopio y se determinó la distribución de la radioactividad.

Resultados

• Después de un ciclo de replicación en presencia de timidina marcada, ambos cromosomas hermanos presentaban radioactividad, distribuida uniformemente a lo largo de toda la longitud de cada cromosoma.
• Después de un segundo ciclo de replicación en un medio sin timidina marcada, solo una de las dos cromátidas de cada cromosoma era radioactiva.

Conclusión

Estos resultados apoyan el modelo de duplicación semiconservativa del ADN. Si la duplicación fuera conservativa, después del primer ciclo de replicación, solo uno de los dos cromosomas hermanos sería radioactivo. Si la duplicación fuera dispersiva, ambos cromosomas hermanos tendrían una mezcla de ADN marcado y no marcado después de cada ciclo de replicación.

Uso de la colchicina en el trabajo de Taylor

La colchicina se utilizó para detener la división celular en la metafase. Esto permitió a Taylor visualizar y analizar los cromosomas duplicados y determinar la distribución de la radioactividad en ellos.

Trabajo de Arthur Kornberg

OBJETIVO: Duplicar el ADN en una molecula gigante y biológicamente activa. PROBLEMA: Como duplicar el ADN en una molecula gigante y biológicamente activa?MATERIALES: Aminoacidos (forman la nueva molecula de proteína), isotopos o marcadores (marcan a los aminoácidos), ADN preformado (extracto libre de células) de medula osea , glandula del timo, E. Coli, ARN, ATP y enzimas. REFERENCIAS ANTERIORES: *Watson y Crick habían propuesto sus modelos de doble hélice del ADN, el acido nucleico transmite la información genética excepto en ciertos virus. El objetivo era conseguirlo en 1 año pero fue 14 años después que utilizando ADN natural como patrón consiguieron ADN completamente sintetico.*Pasteur propuso que la celula viva de levadura desempeña un papel esencial en el proceso de fermentación. PROCEDIMIENTO:*Partiendo del hecho de que pueden sintetizarse grandes moléculas en sistemas libres de células con la ayuda de enzimas, Kornberg tomo un tubo de ensayo y le coloco los extractos de medula osea,ARN,enzimas,aminoácidos e isotopos y realizo un in vitro. * Utilizo los isotopos para marcar los aminoácidos, las enzimas para transportarlos, el ARN para dirigirlos y el ATP para establecer los enlaces bioquímicos entre ellos. * Los nucleótidos estaban formados por un grupo fosfato unido al azúcar de 5 carbonos desoxirribosa.* Se apoyaron en 2 tecnicas para lograr la síntesis del acido nucleico, la 1era indicaba el uso de materiales radioactivos para marcar el nucleótido de modo que se viera fácilmente el acido nucleico y el 2do que exploto el hecho de que el acido nucleico se precipitase acidulando el medio. RESULTADOS:  el in vitro arrojo resultados negativos por lo que se uso mas ADN-polimerasa para unir las moléculas fraccionadas obtenidas en el experimento, pero nunca fueron biológicamente activas ninguna de las 3 muestras debido a que no controlaron la pureza del ADN preformado. Por ello se cambio a E.Coli que tiene la virtud de reproducirse en 20min.2DA PARTE DEL TRABAJO DE KORNBERGWatson y Crick muestran una cadena de polinucleotidos normal y otra gigante en la que se muestra la perdida de afinidad entre ambas debido a que el ARN al momento de sintetizar tiene una vida limitada. HIPOTESIS: Si fue posible obtener una molecula gigante de ADN pero no biológicamente activa entonces viendo una molecula simple de ADN obtendremos nuestro propósito.VIRUS ΘX174: posee una cadena simple de ADN, infecta a la bacteria E.Coli y mata al huésped.CARACTERISTICAS DE UN VIRUS:*forma poliédrica o geométrica*estructura: capsula-proteina, particula viral ADN o ARN *no son seres vivos ya que son muy pequeños, no realizan metabolismo.*Solo activan en huéspedes susceptibles.*Tecnica de Vinograd:*ADN preformado ΘX174*Aminoacidos*Isotopo: Bromouracilo (sustituye la base nitrogenada del ARN marcado) *ARN *ATP*Enzimas*En un tubo de ensayo el bromouracilo va debajo del ADN viral debido a que el primero pesa mas. EXPLICACION DEL TRABAJO DE KORNBERG: (SIN DIBUJOS)*Se coloca en un tubo de ensayo los aminoácidos,isotopos,ATP,ARN, ADN preformado. A dicho tubo ya se le había agregado una muestra del virus Θx174 cuya capsula que los recubría se encontraba fraccionada y marcada por los isotopos. (no es biológicamente activa)*Se le agrega ADN-polimerasa para unir la parte fraccionada de la capsula. (Biologicamente activa)*Se le agrega la ADN-asa, fractura la molecula de ADN natural y artificial.*Se repite todo de nuevo desde el paso 1. ADN sintetico y se le agrega ADN-polimerasa*Vuelve a ser biológicamente activo.