Métodos de Esterilización

Se refiere a la eliminación completa de todos los microorganismos, incluyendo formas vegetativas y esporas, de un objeto o superficie. A continuación, se describen los métodos más comunes:

Agentes Físicos

1. Calor

Calor Húmedo

• Autoclavado: El método más eficiente. Se utiliza un autoclave para esterilizar con vapor a alta presión (121°C, 15 psi) durante un tiempo determinado.
• Tindalización: Se utiliza para líquidos o materiales que no resisten el autoclave. Consiste en calentar el material varias veces a temperaturas entre 56°C y 100°C, con intervalos de tiempo para permitir la germinación de esporas.
• Uperización: Se calienta el líquido a 150°C durante 1-5 segundos y luego se enfría rápidamente a 4°C. Se utiliza principalmente para la leche.

Calor Seco

• Horno Pasteur: Utiliza aire caliente a 160-180°C durante 1-2 horas para esterilizar material de vidrio y metal.
• Flameado: Se utiliza para esterilizar asas de siembra y bocas de tubos de ensayo. Se expone el material a la llama de un mechero Bunsen hasta que se ponga al rojo vivo.
• Incineración: Se utiliza para eliminar material contaminado. Se quema el material a altas temperaturas.

2. Filtración

Se utiliza para esterilizar líquidos y gases que no resisten el calor. Se hace pasar el fluido a través de un filtro con poros lo suficientemente pequeños como para retener los microorganismos.

3. Radiación

• Radiación Ionizante (Rayos X, Gamma): Más efectiva que la radiación no ionizante. Provoca la formación de iones y radicales libres que dañan el ADN de los microorganismos.
• Radiación No Ionizante (UV): Provoca alteraciones en el ADN de los microorganismos. Se utiliza para la desinfección de superficies y aire.

Agentes Químicos

• Óxido de Etileno: Gas con propiedades alquilantes que destruyen los microorganismos por alteración de proteínas y ácidos nucleicos.
• Formaldehído: Agente líquido alquilante, efectivo contra virus y toxinas. Su uso es limitado por su alta toxicidad.
• Glutaraldehído: Líquido alquilante que destruye formas vegetativas y esporas eficazmente. Se utiliza para instrumental de fibra óptica (endoscopios).

Pasteurización

Método que permite disminuir el número de microorganismos en un líquido, pero no es un método de esterilización.

Medios de Cultivo

Son sustancias nutritivas que se utilizan para el crecimiento y desarrollo de microorganismos en el laboratorio. Un medio de cultivo debe contener:

• Agua
• Sustancias orgánicas como fuente de carbono
• Fuentes de nitrógeno, fósforo y azufre
• Sales minerales

Requerimientos Específicos

• Factores Orgánicos de Crecimiento: Vitaminas, purinas, pirimidinas, aminoácidos.
• Suplementos: Nutrientes que, sin ser vitales, favorecen el desarrollo de los microorganismos, como peptonas, extracto de carne y levaduras.

Agentes Solidificantes

Se utilizan para la preparación de medios de cultivo sólidos y semisólidos. Su función es únicamente solidificar el medio.

• Agar-Agar: Polímero de polisacáridos obtenido de algas rojas. Forma un gel translúcido, insoluble en agua fría, pero soluble en agua caliente. Se mantiene sólido en un amplio rango de temperatura (10-80°C).
• Gelatina: Proteína compleja de origen animal. Presenta bajo valor nutritivo. Su uso es limitado porque se licua a temperaturas superiores a 28°C.
• Gel de Sílice: Se utiliza para microorganismos con requerimientos específicos, como bacterias autótrofas. Su preparación es lenta y compleja, y su costo es elevado.

Medios de Cultivo Según su Estado Físico

• Líquidos: No contienen agentes solidificantes. Ejemplo: caldo nutritivo.
• Sólidos: Contienen un agente solidificante, generalmente agar-agar. Se utilizan en placas de Petri. Ejemplo: agar nutritivo.
• Semisólidos: Contienen una baja concentración de agente solidificante. Se utilizan en tubos de ensayo. Ejemplo: agar SIM (para pruebas de movilidad).

Medios de Cultivo Según su Composición Química

• Complejos o Indefinidos: No se conoce la composición química exacta. Ejemplo: caldo nutritivo, agar tripticasa de soja.
• Sintéticos o Definidos: Se preparan con sustancias químicas puras. Ejemplo: agar mínimo de glucosa.

Medios de Cultivo Según su Utilización

• Generales: Permiten el crecimiento de una variedad de microorganismos. Ejemplo: caldo y agar nutritivo.
• Selectivos: Contienen sustancias que inhiben el crecimiento de ciertos microorganismos y permiten el crecimiento de otros. Ejemplo: agar MacConkey (para bacterias Gram negativas).
• Diferenciales o Diagnóstico: Permiten diferenciar grupos de microorganismos en función de sus propiedades metabólicas. Ejemplo: agar sangre (para la detección de hemólisis).

Técnicas de Siembra

• Siembra en Medios Líquidos: Se realiza en tubos de ensayo o matraces. El crecimiento se observa por la turbidez del medio.
• Siembra en Medios Sólidos: Se realiza en tubos de ensayo o placas de Petri.
  • Siembra por Estrías: Se utiliza para obtener colonias aisladas.
  • Siembra por Picadura: Se utiliza para determinar la movilidad de los microorganismos.
  • Siembra por Extensión: Se utiliza para obtener un crecimiento uniforme en la superficie del medio.
  • Siembra en Profundidad: Se utiliza para determinar el número de bacterias viables en una muestra.

Aislamiento y Obtención de Cultivos Puros

Se utilizan técnicas de siembra en medios sólidos y selectivos para obtener cultivos puros, es decir, cultivos que contienen una sola especie de microorganismo.

Observación de Microorganismos

Fijación

Proceso que permite adherir el frotis al portaobjetos y preservar la morfología de los microorganismos. Se puede realizar por calor o con agentes químicos como alcohol, éter o formalina.

Tinción

Proceso que permite visualizar los microorganismos al microscopio óptico. Se utilizan colorantes que tiñen las células de forma diferencial.

Observación de Microorganismos Vivos

• Preparación Húmeda: Se coloca una gota de la muestra en un portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos.
• Gota Pendiente: Se coloca una gota de la muestra en un cubreobjetos y se invierte sobre un portaobjetos con una excavación.

Observación de Microorganismos Muertos

1. Preparación del Frotis
2. Fijación
3. Tinción

Tipos de Tinciones

• Tinción de Gram: Permite diferenciar las bacterias en Gram positivas (azules) y Gram negativas (rosas).
• Tinción de Ziehl-Neelsen: Se utiliza para la detección de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR), como Mycobacterium tuberculosis.
• Tinción de Esporas: Permite visualizar las esporas bacterianas. Ejemplo: tinción de Schaeffer-Fulton.