Métodos de Esterilización

Todo el material y herramientas deben ser esterilizados. Existen diferentes métodos de esterilización:

Agentes Físicos

1. Calor

Calor Húmedo

• Autoclavado: (más eficiente) con un autoclave.
• Tindalización: para líquidos o materiales que no resistan el autoclave. Es calentando varias veces.
• Uperización: 150°C 1-5 seg. enfriar a 4°C (leche)

Calor Seco

• Horno Pasteur: aire caliente.
• Flameado: asas de Drigalsky y pinzas, se realiza un flameado con alcohol.

2. Filtración

3. Radiación

Las radiaciones ionizantes (rayos X, gama) son más efectivas que las no ionizantes (radiación UV).

Radiación No Ionizante (UV)

Provoca alteraciones en el ADN, se ocupa para mesones.

Radiación Ionizante

Radiación electromagnética de alto poder de penetración, que genera iones y especies moleculares reactivas, como OH, H, las cuales degradan el ADN.

Agentes Químicos

• Óxido de etileno: es un gas con propiedades alquilantes, que destruyen los microorganismos por alteración de proteínas y ácidos nucleicos.
• Formaldehído: agente líquido alquilante, efectivo contra virus y toxinas, sin embargo no se utiliza por su alta toxicidad.
• Glutaraldehído: líquido alquilante que destruye formas vegetativas y esporas eficazmente, pero con largos tiempos de exposición. Se utiliza para instrumental de fibra óptica (endoscopios).

Pasteurización

Es un método que permite disminuir el número de microorganismos, no es esterilización.

Medios de Cultivo

Siempre debe tener:

• Agua
• Sustancias orgánicas como fuente de carbono
• Fuentes de nitrógeno, fósforo y azufre
• Sales minerales

Requerimientos específicos

• Factores orgánicos de crecimiento, vitaminas, purinas, pirimidinas, aminoácidos.
• Suplementos: nutrientes que no siendo vitales para los microorganismos, favorecen de manera significativa su desarrollo: peptonas, extracto de carne y levaduras.

Agentes solidificantes

Para la preparación de medios de cultivo sólidos y semisólidos. Su única función es solidificar el medio, por lo tanto no deben ser utilizados como nutrientes por los microorganismos.

Agar-agar

• Es un polímero formado de polisacáridos, principalmente galactosa, se obtiene de algas rojas.
• Es un gel translúcido.
• Insoluble en agua fría, pero se funde a 100º C.
• Se mantiene sólido en un amplio rango de temperatura (10º – 80º C).
• No altera el pH del medio de cultivo.
• Es degradado por un reducido grupo de microorganismos.

Gelatina

• Es una proteína compleja de origen animal, obtenida por hidrólisis parcial del colágeno.
• Presenta bajo valor nutritivo por carecer de los aminoácidos valina, tirosina y triptófano.
• Su uso es limitado porque:
  • Se licua espontáneamente sobre 28º C.
  • Es insoluble en agua fría.
  • Es hidrolizada por proteasas.

Gel de sílice o sílica gel

• Sirve sólo para microorganismos con requerimientos específicos, bacterias autótrofas.
• Su preparación es lenta y compleja.
• Su costo es elevado.

Medios de Cultivo según Estado Físico

Medios Líquidos

Son aquellos que no tienen agentes solidificantes. NaCl, agua destilada, peptona.

Medios Sólidos

Contienen un agente solidificante, generalmente agar-agar en una concentración de 1,5 a 2% p/v. Se distribuyen en placas de Petri lo que permite observar y caracterizar las colonias de los microorganismos, agar-agar, NaCl, peptona soya caseína.

Medios Semisólidos

Contienen un agente solidificante en una concentración de 0,1 a 0,8%, se utilizan en tubos de ensayo para el test de movilidad y pruebas bioquímicas. K2HPO4, azul de bromotimol, agar-agar.

Medios de Cultivo según Composición Química

Medios Complejos o Indefinidos

No se sabe exactamente su composición, nutren el medio. Caldo nutritivo, tripticasa de soja.

Medios Sintéticos o Definidos

Se preparan con sustancias químicas puras orgánicas e inorgánicas, K2HPO4, agar-agar, citrato de sodio, azul de bromotimol.

Medios de Cultivo según su Utilización

Medios Generales

Su composición permite el crecimiento de una variedad de microorganismos sin requerimientos nutricionales específicos, caldo y agar nutritivo.

Medios Selectivos

Tienen algún componente que inhibe o dificulta el crecimiento de ciertos microorganismos permitiendo el crecimiento de otros. Los componentes inhibidores generalmente son colorantes, antibióticos o sales. Triptona, cloruro de litio.

Medios Diferenciales o Diagnóstico

Permiten diferenciar grupos de microorganismos en función de sus propiedades metabólicas. Caldo y agar nutritivo, la mayoría de los medios selectivos como agar MacConkey o Baird Parker.

Técnicas de Siembra

Siembra en Medios Líquidos

Ésta se realiza en tubos de ensayo o en matraces. El crecimiento se observa por la turbidez del medio, por la formación de velo o película superficial, o por acumulación de microorganismos en el fondo del tubo. Crecimiento de microorganismos en medios de cultivo líquido a) velo superficial; crecimiento en el fondo del tubo; c) turbidez en todo el tubo; d) tubo control.

Siembra en Medios Sólidos

Se realiza en tubos de ensayo o en placas de Petri, tiene distintos usos, según el objetivo del cultivo a realizar.

Siembra por Estrías en Tubo

Siembra por Picadura

Se utilizan tubos con agar y se agrega el inóculo con el asa en punta. El asa se introduce en el centro del agar con un solo movimiento. Se observa el crecimiento en la línea de inoculación. En agar semisólido, se utiliza para la prueba de movilidad.

Siembra por Extensión en Placa

Consiste en poner un inóculo en la superficie del agar y luego extenderlo sobre el medio. La extensión del inóculo se puede hacer con asa de loop, técnica denominada “siembra en estrías” o el asa de Drygalsky, técnica denominada “siembra homogénea”.

Siembra por Estrías

Siembra Homogénea

Siembra en Profundidad

Determinar el número de bacterias viables, anaerobias facultativas y microaerófilas presentes en la muestra.

Aislamiento y Obtención de Cultivos Puros

Técnicas: Se realizan en medios de cultivos sólidos y selectivos: Agotamiento por estrías, dilución y siembra en placa (para contar). La obtención de un cultivo puro se enriquece (aumenta volumen y cantidad). Hay métodos físicos (temperatura, radiación), químicos y biológicos. El agar MacConkey tiene sales biliares que inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias excepto Salmonella y E. coli.

Observación de Microorganismos

Fijación

En las tinciones, la adherencia del frotis al portaobjetos se realiza por procedimientos físicos como calor o químicos como alcohol, éter, formalina (los microorganismos mueren).

Mordiente

Compuesto que favorece la permanencia del colorante en la célula, como el lugol.

Observación de Microorganismos Vivos

• Preparación húmeda
• Gota pendiente (se observa forma, tamaño, movilidad)

Observación de Microorganismos Muertos

1. Preparación del frotis
2. Fijación
3. Tinción

Tinción de Gram

Bacterias Gram negativas (E. coli) se tiñen de rosa, Gram positivas se tiñen de azul. Extensión, cristal violeta, lavar, lugol, lavar, alcohol, lavar, safranina, lavar, secar, observar.

Tinción Ziehl-Neelsen (BAAR)

Bacterias ácido-alcohol resistentes, resisten la decoloración, Mycobacterium, Nocardia. Tienen paredes gruesas, por ácidos micólicos. Se utiliza la tinción de Ziehl-Neelsen (caliente) o Kinyoun (frío). Extensión, fucsina, lavar, decolorar, lavar, azul de metileno, lavar, observar.

Tinción de Esporas (Schaeffer-Fulton)

Tinción especial que permite ver esporas, flagelos. Cubrir el frotis con verde de malaquita, en frío, calentar, se producen emisiones de vapor, se agrega papel filtro y colorante, lavar, safranina, lavar, observar. Esporas (verdes), formas vegetativas (rosas).