Confección del frotis – pueden prepararse a partir de productos líquidos o sólidos.
Productos sólidos – se pasa sobre la superficie del portaobjetos el hisopo con el que se ha tomado la muestra. También se puede preparar una suspensión del material en una gota de agua o solución salina, previamente colocada en el portaobjetos.
Productos líquidos – a) Para la preparación del frotis se coloca sobre el portaobjetos una gota del material y se extiende con el asa de siembra. b) Secado – se dejará secar el frotis a temperatura ambiente. Para ello, se puede agitar varias veces el porta al aire hasta comprobar su secado. c) Fijación – tiene como objetivo la inmovilización de las estructuras del material a estudiar en un estado lo más próximo al estado natural. Las formas más habituales de fijación son: Calor, Alcohol en frío. d) Coloración – es el proceso de coloración de los microorganismos. Para teñirlos, existe un gran número de productos químicos con propiedades colorantes. Su elección está condicionada al tipo de tinción a realizar. e) Lavado y secado – es la eliminación del exceso de colorante. Para el lavado se utilizará el frasco lavador, teniendo precaución de no dirigir el chorro directamente al frotis. El secado se sitúa en posición inclinada y al aire.
Clasificación: 1. Tinción simple – una solución acuosa o alcohólica de un colorante básico. Aunque los diferentes colorantes se unen de forma específica a las distintas partes de las células, el propósito principal de una tinción simple es destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares básicas. El colorante se aplica al extendido fijado durante un tiempo determinado y luego se lava; a continuación, el portaobjetos se seca y se examina. En ocasiones, se agrega una sustancia química a la solución para intensificar la coloración; este aditivo se denomina mordiente. Una de las funciones de un mordiente es aumentar la afinidad de una muestra biológica por un colorante; otra es cubrir una estructura (como un flagelo) para darle mayor espesor y facilitar la observación después del teñido. Algunos de los colorantes simples utilizados con frecuencia en el laboratorio son el azul de metileno, carbolfucsina, cristal violeta y safranina.
Tinciones diferenciales – reaccionan de modo diferente con las distintas clases de bacterias, por lo tanto, pueden ser empleadas para establecer una distinción entre ellas. Las tinciones diferenciales empleadas con más frecuencia para las bacterias son: tinción de Gram y la de Thiel-Nielsen.
Tinción de Gram – fue desarrollada por el bacteriólogo danés Hans Cristian Gram en 1884 y es uno de los procedimientos de tinción más útiles porque permite clasificar las bacterias en Gram+ y Gram-.
Procedimiento – un extendido fijado con calor se cubre con un colorante violeta básico. Como el colorante violeta imparte su color a todas las células, se le denomina colorante primario. Después de un breve lapso, se escurre el colorante violeta, se lava el extendido y se cubre con yodo (mordiente). Cuando se lava el yodo, tanto las bacterias Gram+ como las Gram- aparecen de color violeta oscuro o púrpura. A continuación, se lava el portaobjetos con alcohol o con una solución de alcohol-acetona; esta solución es un agente decolorante que elimina el color violeta de las células de algunas especies, pero no de otras. Se elimina el alcohol con agua y se tiñe el portaobjetos con safranina, un colorante básico. Luego se vuelve a lavar el extendido, se seca con papel absorbente y se examina con el microscopio.
El colorante violeta y el yodo se combinan en el citoplasma de cada bacteria y lo colorean de violeta oscuro o púrpura. Las bacterias que conservan este color después de haberles agregado el alcohol para decolorarlas se clasifican como Gram+. Las que pierden el color violeta oscuro después de la decoloración son Gram-. Como las bacterias Gram- son incoloras tras el lavado con alcohol, dejan de ser visibles; por ese motivo, se les aplica el colorante básico safranina que las convierte en rosadas. Los colorantes como la safranina, que tienen un color que contrasta con el colorante primario, se denominan colorantes de contraste. Dado que las bacterias Gram+ conservan el colorante violeta original, no son afectadas por el colorante de contraste, safranina. Las diferentes clases de bacterias reaccionan de modo distinto frente a la tinción de Gram porque las diferencias estructurales en sus paredes determinan la retención o el escape de una combinación de colorante violeta y el yodo, denominada complejo violeta-yodo.
En otras diferencias, las Gram+ tienen un peptidoglicano en su pared celular más grueso que las Gram-. Además, las Gram- contienen una capa de lipopolisacárido como parte de su pared celular. Cuando se aplica el colorante violeta y luego el yodo, ingresan con facilidad en las células, en cuyo interior se combinan para formar el complejo; este complejo es más grande que la molécula del colorante violeta que ingresó en las células y, por su tamaño, no puede ser eliminado por el agregado de alcohol.
Por consiguiente, las células Gram+ retienen el color del colorante violeta. En cambio, en las células Gram-, el alcohol altera la capa externa de lipopolisacárido y el complejo se elimina de la capa delgada de peptidoglicano. Como consecuencia, las células Gram- son incoloras hasta que se agrega el colorante de contraste safranina.
El método de Gram es una de las técnicas de tinción más importantes en microbiología, pero sus resultados no pueden aplicarse de modo universal. La coloración de una bacteria mediante la tinción de Gram puede proporcionar información valiosa para el tratamiento de ciertas enfermedades. Las Gram+ suelen ser destruidas con facilidad por las penicilinas y las cefalosporinas, y las Gram- por lo general son más resistentes porque los antibióticos no pueden atravesar la capa de lipopolisacárido. Parte de la resistencia a estos antibióticos entre las bacterias Gram+ y Gram- se debe a la inactivación bacteriana de los antibióticos.
Tinción de Ziehl-Neelsen – tinción de ácido-alcohol resistencia que se fija de modo firme solo a las bacterias que poseen ceras en las paredes de sus células. Los microbiólogos utilizan esta tinción para identificar otras bacterias del género Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae. Esta tinción se utiliza para identificar las cepas patógenas del género Nocardia.
Procedimiento – se aplica el colorante rojo carbol fucsina a un extendido fijado y se calienta suavemente durante varios minutos (el calentamiento aumenta la penetración y la retención del colorante). Luego se enfría el portaobjetos y se lava con agua; a continuación, se trata con ácido-alcohol, un decolorante que elimina el color rojo de las bacterias que no son ácido-alcohol resistentes. Los microorganismos ácido-alcohol resistentes retienen el color rojo porque la carbol fucsina es más soluble en los lípidos de la pared celular que los ácido-alcohol resistentes. En las bacterias que no son resistentes, las paredes carecen de componentes lipídicos y la carbol fucsina se elimina con facilidad, lo que deja las células incoloras. Luego, el extendido se colorea con azul de metileno, que actúa como colorante; las bacterias que no son resistentes aparecen azules después de aplicar el colorante de contraste.
Tinción de esporas – 1. Tinción de Moeller – ácido crómico, fucsina de Ziehl-Neelsen, solución acuosa de clorhidrato de anilina, solución de azul de metileno y alcohol absoluto. Las esporas se observan con objetivo de inmersión y se visualizan color rojo o rosado y las bacterias de color azul. 2. Tinción de Wirtz-Conklin – solución acuosa de verde malaquita y solución acuosa de safranina. Si se observan con el objetivo de inmersión, las esporas se habrán teñido de verde y las bacterias de color rojo intenso.
Tinción de flagelos – en la preparación de la muestra se deben emplear portaobjetos nuevos, limpios y tratados con una mezcla sulfocromática y perfectamente aclarados con agua destilada.
Tipos: 1. RHODES – mordiente de Rhodes y el nitrato de plata amoniacal. Los flagelos se pueden observar gracias al precipitado negro que se ha depositado en torno a la estructura. 2. Tribondeau – mordiente de Tribondeau y solución de violeta cristal. Los flagelos se ven de color castaño. 3. Leifson – colorante Leifson. Se observan de color rojo o azul negruzco.