Anexo 1: Recomendaciones para el Uso de Fenol y Formaldehído

Los laboratorios que empleen formaldehído en sus reactivos deben utilizar una campana de extracción de gases con capacidad suficiente para asegurar concentraciones inferiores al límite ambiental de 0.3 ppm (0.37 mg/m³) en exposiciones cortas. Si no se posee este equipo, los operadores deben emplear elementos de protección personal para las vías aéreas, piel, y salpicaduras, tales como guantes, delantal, gafas y máscara facial. Si se quiere evitar por completo la inhalación de vapores, se debe recurrir a la utilización de equipos de protección respiratoria que incluyan filtros químicos tipo BP3 y asegurar recambios de aire.

Para el uso de fenol, se debe usar ventilación por extracción localizada en lugares de emisiones químicas y aislar del resto del personal el proceso de manipulación. También se pueden utilizar respiradores apropiados en conjunto con protección para el personal. Es importante mantener informado al personal sobre los riesgos a los que se exponen y cómo actuar en caso de accidente.

El laboratorio puede evaluar el reemplazo del formaldehído y de otros reactivos nocivos para la salud en ciertas metodologías, pero debe mantener su eficiencia original, incluyendo la inactivación efectiva de los parásitos, la preservación y la facilitación del proceso de tinción. Aunque en algunos métodos como PVA se han reemplazado por reactivos menos nocivos para la salud, los resultados no han sido tan buenos como el original.

Anexo 2: Instrucciones para la Toma de Muestra para Enteroparasitosis

1. Llenar el frasco con el nombre completo y la fecha de obtención de la muestra.
2. Defecar en un recipiente limpio y seco, en un pañal o con ayuda de una bolsa plástica sobrepuesta en la taza para facilitar su recolección.
3. No debe mezclar las deposiciones con orina o talco.
4. No debe haber ingerido antibióticos en días previos, quimioterápicos, fármacos en base a carbono, ni medicamentos específicos contra la o las parasitosis que se investigan.
5. Debe colocar un trozo de materia fecal del tamaño de una nuez; en caso de que sea líquida, debe equivaler a una cucharada.
6. Revolver con el agitador adjunto hasta que se disuelva en el líquido del frasco.
7. Repetir día por medio hasta completar los tres frascos. (El líquido del frasco es tóxico, mantener fuera del alcance de los niños; en caso de ingesta, debe llevarse inmediatamente a urgencias).

Anexo 3: Método de Burrows Modificado

Materiales y Equipos

• Vasos de vidrio
• Pisetas
• Mallas de tamizaje de bronce fosfórico, cobre o acero, abertura de 425 μm de diámetro, hilo 250 μm
• Paleta de madera o baqueta de vidrio
• Tubos de centrífuga graduados con 15 ml de capacidad, cónicos, de plástico desechable y con tapa
• Portaobjetos
• Cubreobjetos de 22 x 22 mm
• Máscara de seguridad de uso individual con filtro para formaldehído tipo BP3
• Centrífuga no refrigerada
• Cámara de extracción de gases
• Suero al 0.85%
• Fijador PAF
• Acetato de etilo, que reemplaza al éter etílico por razones de seguridad

Tinción

El método de Burrows modificado fue descrito usando una solución de tionina como colorante, aunque en su ausencia se podrían usar como opción las siguientes soluciones:

• MIF
• Solución de yodo o Lugol
• CVS

De los colorantes mencionados, esta normativa recomienda el uso de CVS. Sin embargo, el laboratorio debe elegir la o las tinciones para las cuales el observador se sienta más cómodo y le permitan una mejor distinción de los elementos presentes en la muestra.

Preparación de Soluciones

a. Fijador PAF

• Cristales de fenol: 20 g
• Suero (0.85%): 825 ml
• Etanol al 95%: 125 ml
• Formaldehído en solución (37-40%): 5 ml

Disolver los cristales de fenol y formaldehído en el suero al 0.85%. Mezclar bien y guardar el frasco en un lugar fresco. El fenol líquido (23 ml) puede reemplazar a los 20 g de fenol en cristales.

b. Suero 0.85%

• NaCl: 8.5 g
• Agua destilada: 1000 ml

Preparación de la Tinción

a) Solución MIF

• Solución de yodo o Lugol: 0.10 ml
• Formaldehído en solución (37-40%): 0.15 ml
• Timerosal 1/1000: 0.75 ml

Debe prepararse a diario.

b) Solución de Yodo o Lugol

• Yodo: 1 g
• Yoduro de potasio: 2 g
• Agua destilada: 30 ml

Guardar en frasco ámbar por no más de 1 mes.

c) Solución de Tionina 0.1%

• Tionina en polvo: 10 mg
• Agua destilada: 100 ml

Filtrar con papel filtro varias veces hasta que no se produzca precipitación de los cristales al teñir las preparaciones.

d) Solución CVS

Solución A:

• Cristal violeta: 1 g
• Etanol: 6 ml
• Suero 0.85%: 494 ml

Mezclar y filtrar. Guardar en frasco ámbar.

Solución B:

• Safranina: 0.25 g
• Etanol: 10 ml
• Suero 0.85%: 490 ml

Mezclar y filtrar. Guardar en frasco ámbar. Las soluciones A y B se mantienen indefinidamente a temperatura ambiente.

Preparación de la solución de trabajo: Colocar 4 partes de solución A y 10 partes de solución B. Mezclar. Guardar en frasco ámbar. Etiquetar.

La solución de trabajo de la tinción CVS mantiene sus propiedades por lo menos hasta 3 meses desde el momento de su preparación.

Desarrollo del Método

1. En el procesamiento de muestras, al igual que para los otros métodos aplicados a fluidos corporales, se deben guardar las precauciones contenidas en los manuales de bioseguridad.
2. Numerar los 3 frascos del paciente con el mismo número.
3. Numerar 2 portaobjetos diferenciando la Fase T de la Fase Q, 2 vasos y 1 tubo de centrífuga con el mismo número de los frascos.
4. Homogenizar el contenido de los frascos mediante la ayuda de una paleta de madera.
5. Vaciar todo el contenido de cada frasco en un vaso y agregar suero 0.85% con la precaución de efectuar una buena dilución y homogenización.
6. Tamizar la emulsión a través de la malla colocada en un vaso limpio.
7. Ver el material retenido en la malla en busca de parásitos macroscópicos.
8. Poner aproximadamente 12 ml de tamizado en un tubo de centrífuga.
9. Centrifugar por 3 minutos a 1800 rpm.
10. Eliminar el sobrenadante invirtiendo el tubo. Si el sedimento es menor de 0.5 ml, agregar del tamizado hasta lograr un sedimento de 0.5 a 0.6 ml. Resuspender con suero 0.85% y centrifugar de nuevo.
11. Resuspender el sedimento hasta 2 ml con suero 0.85% y agitar para soltar el sedimento.
12. Completar a 12 ml con suero 0.85% y centrifugar por 3 minutos a 1800 rpm aproximadamente.
13. Repetir los pasos 11 y 12 entre 2 y 4 veces hasta obtener un sobrenadante limpio o transparente.
14. Poner una gota de tinción por portaobjeto marcado con la letra T (fase trofozoítica).
15. Poner una gota de sedimento junto a cada gota de tinción.
16. Con un ángulo del cubreobjetos, mezclar el sedimento y la tinción; luego cubrir.
17. Guardar en cámara húmeda.
18. Resuspender el contenido del tubo de sedimento con suero 0.85% hasta 10 ml.
19. Agregar 2 ml de acetato de etilo.
20. Tapar el tubo y agitar enérgicamente por 30 segundos. Destapar lentamente.
21. Centrifugar por 3 minutos a 2000 rpm.
22. Vaciar todo el sobrenadante de una sola vez, en forma rápida, invirtiendo el tubo.
23. Resuspender el sedimento en 1 ml de suero 0.85% y homogenizar.
24. Proceder como en el punto 14 y marcar el portaobjetos con la letra Q (fase quística).
25. Proceder igual que en los puntos 15 y 16.
26. Colocar en cámara húmeda hasta su lectura. Estas preparaciones se pueden conservar hasta 24 horas en la cámara húmeda en un lugar fresco o refrigerar entre 2 y 8 °C.
27. Ver las muestras recorriendo totalmente la preparación e informar siguiendo el esquema de orientación de lectura de las preparaciones.

¿Qué son los Antibióticos?

Sustancias químicas producidas por organismos vivientes, o sintetizadas en laboratorio, capaces de inhibir procesos vitales de microorganismos, impidiendo su desarrollo y reproducción.

¿Qué es un Antibiograma?

Método o prueba que determina la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos.

¿Qué Medio Usamos para Realizar un Antibiograma?

Agar Muller-Hinton.

Método de Difusión en Disco (Kirby-Bauer)

Es el más difundido. Prueba de inhibición o resistencia de microorganismos, enfrentándolos con discos de papel filtro impregnados con medicamentos (antibióticos).

Factores que Influyen en el Agar M-H

• pH (7.2–7.4)
• Profundidad del agar (3-5 mm)
• Preparación del inóculo (0.5 Mc Farland)
• Inoculación de la placa
• Aplicación de sensidiscos (antibióticos):
  • 24 mm entre uno y otro
  • 12 discos/placa de 150 mm
  • 5 discos/placa de 100 mm

Lectura e Interpretación de Halos

Categorías de Interpretación

• Sensible (S)
• Intermedio (I)
• Resistente (R)

Método de E-test

Consiste en aplicar sobre un medio de cultivo donde se encuentra el microorganismo en estudio, una tira plástica impregnada con un gradiente de concentración de un determinado antibiótico. Luego se incuba y, posteriormente, se observa la elipse de inhibición del crecimiento.

Concentración Inhibitoria Mínima (CIM)

Es la menor concentración de una gama de diluciones de antibióticos que provoca la inhibición de cualquier crecimiento bacteriano visible.

Batería Bioquímica para Identificación de Enterobacterias

• TSI
• LIA
• MIO
• Citrato
• Urea

Sistema API

La batería de pruebas API es un sistema de identificación rápida para bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram negativas. Consta de 21 tests bioquímicos estandarizados y miniaturizados y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir hacer numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioquímica distinta. Los microtubos se inoculan con una suspensión de microorganismos, en agua o solución salina, que rehidrata los medios. Las tiras o galerías se incuban a 37 °C y, por efecto del metabolismo bacteriano, se producen cambios de color espontáneos o bien por la adición de reactivos. La lectura de las reacciones se hace mediante comparación con una tabla de lectura donde se indica si los microorganismos deben considerarse positivos o negativos para cada reacción según el color aparecido.

Transporte de Muestras

• Cary Blair: tapa roja
• Medio Stuart: tapa azul

Normas Generales para la Obtención de Muestras

• Se debe hacer en condiciones de máxima asepsia, evitando contaminaciones ambientales, del personal médico y del propio enfermo.
• No debe estar en contacto con sustancias desinfectantes.

Orden de Solicitud de Examen

• Identificación del paciente.
• Datos de la muestra (hora de recogida, tipo de muestra, diagnóstico, localización anatómica, procedimiento de obtención de la muestra).

Identificación de la Muestra

• Cada muestra debe estar acompañada siempre de una orden.
• El paciente debe identificarse con nombre y apellido, tipo de muestra, fecha y hora de extracción.

Criterios de Rechazo de Muestras Bacteriológicas

• Muestras sin orden o con órdenes incompletas y/o fallo de identificación de la muestra.
• Muestras derramadas o rotas.
• Muestra no adecuada para la prueba solicitada.
• Muestras sin medio de transporte adecuado.

Bioseguridad

“Aplicación de conocimientos, técnicas y equipamientos para prevenir a personas, laboratorios, áreas hospitalarias y medio ambiente de exposición a agentes infecciosos o considerados de riesgo biológico”.

Equipo de Protección Personal (EPP)

• Guantes
• Pecheras plásticas
• Mascarillas

REAS: Residuos en Áreas de Atención en Salud

• La legislación data de 1994.
• Decreto N°148/2004 Reglamento sanitario (Residuos Peligrosos).
• Decreto N°6/2009 REAS (Exigencias Establecimientos SS).

Residuos Biológicos (Tarro Amarillo)

Sangre, placas de cultivos, tejidos de órganos o partes del cuerpo, algodones y gasas.

Residuos Peligrosos Sólidos (Tarro Rojo)

Ampolletas halógenas, fármacos vencidos, contaminados con mercurio, cartuchos de tinta y envases de sustancias químicas.

Cepas ATCC

Herramienta para control interno del laboratorio de microbiología. Son materiales biológicos certificados. La colección certifica que se suministra una determinada cepa, que es un cultivo puro, y que se han realizado las pruebas morfológicas, bioquímicas y moleculares correspondientes. Organización avalada por 21 sociedades.

Adquisición de Cepas de Referencia

Obtención directa a partir de una colección nacional e internacional reconocida, con su respectivo registro y certificado.

• CEPAS NCTC: National Collection of Type Cultures. Londres.
• CNCM: Collection Nationale de Cultures of Microorganismes. París, Francia.
• ATCC: American Type Culture Collection. Rockville, EE. UU.
• CCTM: Collection Nationale de Cultures de Microorganismes. Institut Pasteur.
• NCYC: National Collection of Yeast Cultures. Norwich, Reino Unido.
• NCIMB: National Collections of Industrial and Marine Bacteria.
• CECT: Colección Española de Cultivos Tipo.

MICROBIOLOGICS®

Primer fabricante de productos biológicos con licencia aprobada por ATCC®. Patente de distribución ATCC desde 2004.

Utilidad de los Cultivos (Cepas) de Referencia ATCC en el Control de Calidad Interno

• Evalúa la calidad de los medios de cultivo.
• Asegura la calidad de los resultados de ensayos de laboratorio (coloraciones y desempeño de reactivos).
• Valida métodos microbiológicos (pruebas de sensibilidad).

Tinción de Ziehl-Neelsen

Descrita por Franz Ziehl (bacteriólogo) y Friedrich Neelsen (patólogo). Técnica de tinción diferencial rápida y económica, identifica microorganismos patógenos: Micobacteria, Nocardia, Rhodococcus.

¿Qué Usa la Tinción de BAAR?

Primer colorante: fucsina básica fenicada. Solución decolorante muy fuerte: alcohol + ácido clorhídrico. Colorante de contraste: azul de metileno.

Aplicación de BAAR

1. Extracción: se pone la muestra en un portaobjeto.
2. Fijación: a la llama.
3. Cubrir con fucsina filtrada.
4. Calentar hasta la emisión de vapores 3 veces durante 5 minutos sin dejar de hervir.
5. Lavar con agua.
6. Decoloración: alcohol más ácido clorhídrico por 1 minuto; luego se lava con agua.
7. Se pone colorante azul de metileno y dejar por 2 minutos.
8. Lavar con agua.
9. Secar al aire o con papel secante.
10. Observar al microscopio (positivo: rojo/negativo: azul).

Asociaciones Biológicas

Seres de la Misma Especie

• Sociedades: conservan su individualidad.
• Colonias: no conservan su individualidad.

Seres de Distinta Especie

• Parasitismo: vive a expensas de otro y lo daña.
• Comensalismo: vive a expensas de otro y no lo daña.

Tríada Ecológica

• Agente contagiante (humano, animal).
• Huésped y su variación individual:
  • Estructura genética
  • Inmunidad
  • Edad, nutrición, protección por vacunas
• Ambiente:
  • Medio de transmisión, vía de infección, fuente infectante
  • Probabilidad de contagio: nivel de vida, hábitos y costumbres, terapia y asistencia médica

Parásitos

Eucariontes que viven de otro de distinta especie y le hacen daño. Desarrollan ciclos evolutivos simples o complejos. Se reconoce como ciclo evolutivo o biológico a las etapas secuenciales del desarrollo.

Importancia de la Parasitología

Relevancia Social

• Magnitud epidemiológica, impacto económico, aspectos éticos.

Complejidad Biológica

• Reproducción, adaptación evolutiva, ausencia de vacunas.

Asociación a Factores Antropológicos, Culturales y Biodemográficos

Factores Asociados a las Parasitosis

Socioantropológicos

• Desarrollo de los pueblos, calidad de vida, salud, alimentación.

Factores

• Biológicos: existencia de eslabones del ciclo.
• Geográficos y clima: temperatura, altura.

Parasitología

Huésped

Organismo simple o complejo.

Tipos de Huéspedes

• Accidental o circunstancial para el parásito.
• Definitivo: el parásito alcanza la madurez sexual.
• Intermediario: desarrolla la fase larvaria.
• Paraténico: se corta el ciclo.

Parasitología de Distintas Concepciones de Salud

• Sobrenatural, ambiental, microbiológico, multifactorial.
• Peccei (Roma, 1992):
  • Tríada ecológica
  • Evolución, adaptaciones, mutaciones
  • Intervención histórico: programa de intervención

Enfrentamiento a las Parasitosis

Modelo de Responsabilidad Compartida

• Políticas nacionales de salud.
• Programas de intervención y control.

Necesidad de Enfrentamiento Intersectorial e Interdisciplinario

Intersectorial

• Instituciones gubernamentales.
• Establecimientos y organizaciones de salud.
• Organizaciones comunitarias.

Interdisciplinario

• Médicos, veterinarios, biólogos, químicos, bioquímicos, enfermeros.

Parásitos Según Grado de Parasitismo

Facultativos

Se adaptan a la vida libre.

Obligados

Viven su vida en un huésped, ya sean temporales o permanentes.

Parásitos: Clasificación Morfológica

• Unicelulares: protozoos (forma evolutiva):
  • Trofozoíto: parásito que se alimenta y se reproduce.
  • Quiste: forma de resistencia, permite vivir en condiciones ambientales adversas.
• Pluricelulares:
  • Helmintos: pueden ser planos, cilíndricos, como hojas.
  • Artrópodos.

Parásitos: Clasificaciones

Morfológica

Protozoos, helmintos, artrópodos.

Ubicación Topográfica

Endoparásitos: dentro del organismo. Ectoparásitos: fuera del organismo.

Ubicación en Órganos y Sistemas

Enteroparásitos: intestinos. Histoparásitos: tejidos. Hemoparásitos: sangre (Trypanosoma cruzi, anemia).

Taxonomía

Reino, phylum, clase, orden, género.

Protozoos

• Rizópodos: desarrollan pseudópodos para su locomoción.
• Flagelados: tienen diferente número de flagelos.
• Ciliados: poseen cilios.
• Coccidios: forma de banana, poseen cono apical, reproducciones complejas.
• Microsporidios: poseen esporas.

Reproducción en Protozoos

• Asexuada (binaria, esquizogonia, endodiogenia).
• Sexuada (conjugación, singamia).

Helmintos

• Nematelmintos: gusanos redondos a la sección horizontal.
• Platelmintos: gusanos planos a la sección horizontal:
  • Cestodes: forma de cinta.
  • Trematodes: forma de hoja.

Nematelmintos

Gusanos redondos al corte (diferentes tamaños, se reproducen por huevos o larvas, para crecer desarrollan mudas {ecdisis}). Autóctonos: Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Trichinella spiralis, Toxocara spp.

Cestodes

Gusanos en forma de cinta (diferentes tamaños, hermafroditas, se reproducen por huevos, ciclos evolutivos complejos, desarrollan estados intermediarios denominados larvas (plerocercoides, cisticercoides, etc.)). Autóctonos: Taenia solium, Taenia saginata, Hymenolepis nana, Diphyllobothrium latum, Echinococcus granulosus.

Trematodes

Forma de hoja (reproducción sexuada por huevos, reproducción asexuada pasando por diferentes estados larvales). Autóctono: Fasciola hepatica (Distoma hepático).

Artrópodos

De patas articuladas, simetría bilateral. Cientos de especies, metamorfosis (completa, incompleta). Insectos, arácnidos, crustáceos. Autóctonos: Pediculus spp, Sarcoptes scabiei, Loxosceles laeta, Latrodectus mactans.

Mecanismos Patogénicos de los Parásitos

• Acción sustractora o expoliatriz.
• Acción tóxica (toxinas o metabolitos intermedios).
• Acción alérgica.
• Acción mecánica.

Parasitosis y Clínica

• Horizonte clínico: infectados vs. enfermos.
• Niveles de prevención: 1°, 2° y 3°.
  • Modos de intervención:
    • 1°: Promoción de la salud y protección específica (no hay vacunas).
    • 2°: Diagnóstico y terapia precoz.
    • 3°: Terapia y rehabilitación.
• Zoonosis: infecciones transmitidas en forma natural desde animales vertebrados al hombre y viceversa.
• Ciclos biológicos:
  • Monoxénico: el parásito se desarrolla en una sola especie.
  • Heteroxénico: el parásito requiere más de una especie para desarrollarse.