Técnicas de Siembra

Para aislar los microorganismos presentes tanto en muestras ambientales, de alimentos o en muestras clínicas, es necesario aplicar técnicas de toma de muestras específicas en cada caso. Los procedimientos de toma de muestra deben realizarse en forma aséptica para evitar riesgo de contaminación.

• Siembra en estría
• Siembra en profundidad
• Caldo Brain-Heart

Tinciones

La observación microscópica se puede realizar en fresco (se pueden observar los microorganismos generalmente vivos y su motilidad) o en preparaciones fijadas (la morfología).

Colorantes catiónicos: se combinan fuertemente con estructuras celulares cargadas negativamente, como ácidos nucleicos y pared celular bacteriana. Azul de metileno, cristal violeta y safranina son colorantes catiónicos que se combinan con estructuras de la superficie celular, y que tienen una aplicación general.

Las tinciones pueden ser:

• Simples: un solo colorante, aplicación general.
• Diferenciales: no tiñen de la misma manera a todos los tipos de células. Ejemplo: tinción de Gram.
• Especiales o específicas: para la observación de estructuras celulares como flagelo, cápsula o esporas.

Esporas: no se tiñen fácilmente y es necesario aplicar calor para que penetre el colorante. Se emplea una tinción diferencial que permite distinguir la endospora de la célula vegetativa.

Observación de muestras con tinción simple

1. Inocular la colonia en un portaobjeto.
2. Realice una tinción simple con azul de metileno.
3. Retire el colorante dejándolo escurrir con ayuda de un poco de agua, luego seque y observe con inmersión.

Observación de muestras con tinción de Gram

Medios de Cultivo e Identificación de Enterobacterias

Los nutrientes requeridos para el crecimiento de los microorganismos se clasifican en:

• Universales: son aquellos nutrientes que todos, o bien la mayoría de los microorganismos requieren para su crecimiento.
• Particulares: son nutrientes que varían de acuerdo a la capacidad biosintética del microorganismo que se considere.
• Factores de crecimiento: corresponden a moléculas orgánicas específicas que algunas bacterias necesitan, en muy pequeña cantidad, para crecer, ya que no pueden fabricar por sí mismas, al carecer de parte (o toda) de una ruta biosintética.

Fisiotaxonomía Bacteriana

• Procesos respiratorios que utilizan las bacterias para la obtención de energía.
• Pruebas basadas en el metabolismo glucídico.
• Pruebas basadas en el metabolismo proteico.
• Pruebas basadas en el metabolismo lipídico.
• Investigación de sustancias energéticas nutritivas.

Ejemplos de medios y pruebas:

• Agar TSI
• Agar LIA (Desaminación de lisina)
• Agar MIO (Motilidad, Descarboxilación de ornitina, Producción de Indol)
• Agar Fenilalanina (Deaminación de fenilalanina)
• Caldo urea de Christensen (Degradación de urea por producción de ureasa)

Susceptibilidad a los Antibióticos

Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM)

1. Prepare una suspensión bacteriana con una densidad similar al tubo 0.5 del nefelómetro.
2. Realice la dilución del antibiótico en caldo Mueller Hinton (MH). Tomar 1 ml de la solución que se encuentra a una concentración de 200 ug/ml y deposítelo en el primer tubo con caldo MH, mezcle bien y luego toma 1 ml de este tubo y los mezcla con el segundo tubo y así sucesivamente hasta llegar al tubo número siete. El tubo número 8 no lleva antibiótico (control de la cepa).
3. Colocar dos gotas de la suspensión previamente ajustada a cada uno de los tubos e incubar a 37ºC por 24 horas.

Método de Kirby-Bauer (Difusión en Agar)

1. Preparar suspensión bacteriana con densidad equivalente al tubo 0.5 del nefelómetro.
2. Introduzca una tórula estéril en la suspensión bacteriana y deje que se impregne con la suspensión.
3. Pase la tórula por toda la superficie de una placa de MH.
4. Utilizando una pinza, coloque sensidiscos sobre la superficie del agar, presionando suavemente.
5. Incubar por 24 horas a 37ºC.
6. Observe los halos de inhibición alrededor de los sensidiscos. Posteriormente mida el diámetro de cada halo.

Hongos

Auxonograma

a) Asimilación de azúcares:

1. Realice una suspensión del cultivo de levadura incubada durante 24 hasta 72 horas en Agar Sabouraud, en 5 ml de agua destilada, a una concentración equivalente al 4-5 del Mc Farland.
2. Siembre por difusión 1 ml de la suspensión en Agar Base Nitrógeno fundido en placa Petri y homogenice.
3. Deje solidificar a temperatura ambiente y disponga 4 discos de papel filtro con los diferentes azúcares que se le proporcionarán en cada placa.
4. Incube a 30°C por 24 horas.

b) Asimilación de Nitrato:

1. Realice una suspensión similar al punto anterior a una densidad similar al Mc Farland 1.
2. Siembre por difusión 0,1 ml de la suspensión en Agar Base Carbono fundido en placa Petri, homogenice y deje solidificar.
3. Disponga en el centro de la mitad de la placa algunos cristales de KNO₃ y una gota de agua peptonada al 1% tal como se le indicará.
4. Incube por 48 a 96 horas a 30°C.

Fermentación de Azúcares

1. Inocule la cepa de levadura en caldo glucosado con indicador de pH y producción de CO₂.
2. Incube a 28°C por 10 a 14 días.
3. Observe a las 48 – 72 horas la producción de gas.

Producción de Ureasa

1. Siembre en estría en Agar urea.
2. Incube por 48 horas.

Morfología

1. Siembre por agotamiento sobre Agar Corn Meal.
2. Disponga 3 cubre-objetos desengrasados y estériles en la superficie en forma equidistante.
3. Incube por 48 horas a 28°C.
4. Observe directamente al microscopio.
5. Distinga las estructuras que caracterizan la morfología de su cepa.
6. Identifique su género y especie utilizando las claves que se le proporcionarán.