Mutagénesis Dirigida: Creación de Mutaciones Puntuales en el ADN

La mutagénesis dirigida permite crear mutaciones puntuales en una cadena de ADN. Se pueden realizar inserciones en sitios de corte de restricción dentro de los genes a clonar (autocorte) o mediante mutagénesis basada en PCR, generando un nuevo producto de PCR.

Mutagénesis Dirigida y su Aplicación en el Estudio Funcional de Genes

La mutagénesis dirigida se utiliza para generar aproximaciones funcionales para un gen específico. Para ello, se debe conocer la secuencia de ADN a mutar (Genética Reversa). El objetivo es dirigir la mutación a un sitio específico del genoma y conseguir un cambio en la función de la proteína, por ejemplo, mediante un knock-out para producir una proteína defectuosa o alelos nulos. Esto permite investigar la función génica.

Mutaciones Naturales vs. Mutagénesis Dirigida In Vitro

Las mutaciones naturales ocurren durante la replicación del ADN, con una alteración cada 10⁶-10⁸ bases replicadas. Se pueden inducir mutaciones mediante métodos físicos, químicos o UV, rayos X, gamma, o sulfato de etilmetano (EMS). En plantas, se utiliza la técnica TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) para generar bibliotecas de mutantes. Sin embargo, estas mutaciones son al azar.

La mutagénesis dirigida in vitro, en cambio, no es al azar. Un ejemplo es la mutagénesis por extensión del primer (mutagénesis dirigida por oligonucleótidos), utilizando el fago M13 (ADN de hebra simple). Se utiliza un oligonucleótido que no es 100% complementario, pero el emparejamiento complementario de pares de bases estabiliza el cebador. El extremo 3’OH libre permite iniciar la extensión del primer. La baja eficiencia de la mutagénesis in vitro se debe al sistema de reparación del ADN no metilado en hospederos como E. coli (transformación/clonación). Se pueden generar clones mutantes del ssDNA del bacteriófago M13 para un gen específico.

Incremento de la Eficiencia de la Mutagénesis

Para incrementar la eficiencia de la mutagénesis, se puede enriquecer el ADN con mutantes protegiéndolo del sistema de reparación o degradación (endonucleasas) del hospedero. Una estrategia es el uso de fosforotionatos, donde el grupo fosfato posee P-S en lugar de P-O. Este grupo se incorpora en la hebra de ADN y las nucleasas no lo cortan. El ADN silvestre se corta con la endonucleasa PstI y los extremos libres se degradan con Exo III. Las hebras mutadas por oligonucleótidos P-S y tratadas con enzimas de restricción (ER) quedan protegidas.

Selección de E. coli Mutadas: Método de Kunkel

El método de Kunkel se basa en la obtención de ssDNA (fagémido) crecido en mutantes dobles de E. coli para los genes dut y ung. El gen dut codifica para la dUTPasa, que degrada UTP dentro de la célula. El mutante dut acumula UTP en el ADN. El gen ung codifica para la uracilo-N-glicosidasa, que remueve el uracilo del ADN. El mutante ung no puede remover el uracilo. La transformación de la dsDNA en E. coli ung+ permite la degradación selectiva de las secuencias no mutadas.

• Método I: 40-60% de eficiencia en la permanencia de la mutagénesis.
• Método II: 100% de eficiencia en la permanencia de la mutagénesis.

Mutagénesis por Casete

La mutagénesis por casete depende de dos sitios de reconocimiento para ER que flanquean la zona que se desea mutar. Se incorpora o sustituye el casete cortado (silvestre) por un casete con la mutación (sintetizado). Este método se deriva del ADN plasmídico:

1. Corte con ER.
2. Síntesis comercial de ADN de doble hebra con las mutaciones.
3. Ligación del plásmido cortado. La secuencia silvestre puede tener, por ejemplo, alanina, mientras que la secuencia mutada tiene lisina.

Problemas de la mutagénesis por casete:

1. Se debe conocer la secuencia del gen insertado en el vector.
2. Se necesitan dos sitios de restricción que flanqueen la región a mutar.
3. Los oligonucleótidos pueden ser difíciles de sintetizar, lo que implica costos elevados y la dependencia de compañías de síntesis de ADN.

Mutagénesis por PCR (Overlap)

La mutagénesis por PCR (overlap) utiliza ADN lineal generado por PCR. Se realiza en dos pasos y dos tubos:

Paso 1:

• Dos primers (1 y 4) diseñados con complementariedad a la hebra antisentido y sentido.
• Dos primers (2 y 3) que introducen la mutación en la hebra antisentido y sentido.
• Mezclar los amplicones, desnaturalizar y renaturalizar.

Paso 2:

• Ronda 1: Extensión desde los extremos 3’OH libres.
• Ronda 2: Amplificación de los extremos con los primers 1 y 4.

Los primers 1 y 4 introducen sitios de corte para clonar los PCRs mutados dentro de un vector plasmídico.

Mutagénesis con el Método QuikChange™

El método QuikChange™ permite la mutagénesis directa en un plásmido por PCR. El ADN plasmídico con el gen de interés deriva de una cepa de E. coli dam+ (que metila el ADN silvestre parental). Los cebadores se hibridan en el gen sentido y antisentido, y contienen la mutación deseada. Se digiere con la ER DpnI, que cliva las hebras metiladas (silvestres parentales). Se transforma E. coli silvestre con el plásmido mutado. La maquinaria de reparación bacteriana repara los nicks (huecos producidos por la ADN polimerasa con actividad exonucleasa 5′-3′) y replica el plásmido, fijando la mutación.

Mutagénesis Dirigida en Plásmido (SDM)

La mutagénesis dirigida en plásmido (SDM) es similar al método QuikChange™, también utilizando PCR. Los primers se hibridan en sentido y antisentido.

PCR Propensa a Errores (Error-Prone PCR)

La PCR propensa a errores se ejecuta en condiciones de baja astringencia, generando variantes de productos de PCR. Se basa en los errores que introduce la Taq polimerasa. Naturalmente, la Taq polimerasa no posee actividad de corrección de lectura de tipo exonucleasa 3′-5′, lo que introduce mutaciones aleatorias. Para incrementar los errores de la Taq polimerasa, se puede aumentar la concentración de MgCl₂ o incorporar iones manganeso. También se pueden utilizar concentraciones no equimolares de dNTPs, altas concentraciones de Taq polimerasa y tiempos de extensión elevados (72°C). Los productos de PCR mutados deben ser clonados, secuenciados y expresados para determinar su funcionalidad.

Mutagénesis Dirigida In Vivo

La mutagénesis dirigida in vivo se basa en cortes en locus específicos del ADN de doble hebra (ADNds). Se utilizan:

• Nucleasas de dedos de zinc personalizadas (ZFNs).
• Nucleasas efectoras tipo activador de la transcripción (TALENs).

FokI es una endonucleasa de restricción derivada de Flavobacterium okeanokoites que posee un dominio de unión a ADN en las regiones ZFN y TALEN. Realiza un corte en un sitio específico (DSB). La reparación puede ocurrir por:

A) Unión de extremos no homólogos (NHEJ).

B) Recombinación homóloga.

Esta reparación introduce mutaciones.

CRISPR/Cas9: Edición de Genomas

El complejo CRISPR-Cas de tipo II es un sistema de supervivencia bacteriana antiviral. El ADN guía (ADNg target) utiliza nucleasas guiadas por ARN a sitios específicos (RGNs). Estas RGNs son guiadas por un gRNA (ARN guía) homólogo al sitio específico donde ocurre el DSB (nucleasa Cas9). La nucleasa RGN está asociada a un sitio de repeticiones con información de sitio-dirección para la RGN: CRISPRs (clustered regularly interspaced short palindromic repeats). El sgRNA (single guide RNA) está conformado por el CRISPR RNA (crRNA) y el transactivating CRISPR RNA (tracrRNA). El sistema de reparación HDR (homology directed repair) participa en el proceso.

El motivo adyacente al protoespaciador (PAM), con la secuencia NGG, ubica el sitio de corte de la nucleasa. Herramientas bioinformáticas como CRISPRscan y CHOP-CHOP ayudan en el diseño de los experimentos.