Este documento aborda la formación de las especies reactivas del oxígeno (ROS), los mecanismos de defensa antioxidante del organismo y las implicaciones del estrés oxidativo en la salud.

Determinación de Biomarcadores en Laboratorio

Se describen brevemente los métodos para la determinación de algunos parámetros bioquímicos en el laboratorio:

• Triglicéridos: Determinación mediante hidrólisis por lipasa. Reacciones:

  • Triglicéridos + Lipasa → Glicerol + Ácidos grasos
  • Glicerol + ATP + Glicerol Quinasa (GK) → Glicerol-3-fosfato + ADP
  • Glicerol-3-fosfato + O₂ + Glicerol-3-fosfato Oxidasa (GPO) → Dihidroxiacetona fosfato + H₂O₂
  • 2H₂O₂ + 4-aminoantipirina + 4-clorofenol + Peroxidasa (POD) → Quinoneimina + HCl + 4H₂O

• Bilirrubina: Método de Jendrassick, basado en la reacción de diazotación con bilirrubina y ácido sulfanílico diazotado en medio ácido. La bilirrubina conjugada (BC) reacciona directamente con este reactivo, mientras que la bilirrubina indirecta (BI) requiere un acelerador como la cafeína. Ambas producen azobilirrubina, cuya absorbancia es proporcional a la concentración de bilirrubina en la muestra.

• Creatinina: Reacción de Jaffé.

• Urea: Determinación cinética de la urea. Reacciones:

  • Urea + H₂O + Ureasa → 2NH₃ + CO₂
  • 2NH₄⁺ + 2α-cetoglutarato + 2NADH + Glutamato Deshidrogenasa (GLDH) → 2 Glutamato + 2NAD⁺ + 2H₂O

• Colesterol: Se determina mediante hidrólisis enzimática del éster de colesterol. Reacciones:

  • Éster de colesterol + H₂O + Colesterol Esterasa (CHE) → Colesterol + Ácido graso
  • Colesterol + O₂ + Colesterol Oxidasa (CHO) → Colesten-3-ona + H₂O₂
  • 2H₂O₂ + 4-aminoantipirina + Fenol + Peroxidasa (POD) → Quinoneimina + 4H₂O

Nota: La absorbancia de la creatinina aumenta con el tiempo, mientras que la del compuesto coloreado en la determinación de urea disminuye.

Solución estándar: Disolución con una concentración conocida de un elemento o sustancia específica.

Blanco: Solución con una composición idéntica a las demás soluciones, pero sin la muestra ni el colorante.

Especies Reactivas del Oxígeno (ROS)

El oxígeno es esencial para la vida de los organismos aerobios. Entre el 80% y el 90% del oxígeno captado se utiliza en la fosforilación oxidativa para producir energía, el 10% es utilizado por enzimas dependientes de oxígeno y menos del 1% se transforma en ROS. Los ROS actúan como sustratos de diversas enzimas, participan en el sistema inmunitario y funcionan como metabolitos. En pequeñas cantidades, los ROS desempeñan un papel crucial en el organismo, pero en exceso causan daño crónico a las biomoléculas. El organismo posee agentes antioxidantes que protegen contra estas especies reactivas.

El oxígeno es el aceptor final de electrones en la cadena respiratoria, reduciéndose para formar agua. A través del complejo IV (Citocromo C oxidasa), el oxígeno se reduce completamente, formando dos moléculas de agua por cada molécula de oxígeno. Este proceso implica una transferencia secuencial de cuatro electrones. Durante esta transferencia, los electrones pueden reducir parcialmente al oxígeno, formando especies reactivas del oxígeno (ROS) si algún electrón se escapa. Las ROS son muy inestables y reactivas. Las más importantes son:

• Singlete de oxígeno (¹O₂)
• Anión superóxido (O₂^–)
• Peróxido de hidrógeno (H₂O₂)
• Radical hidroxilo (HO^·)

Estos son radicales libres de oxígeno con uno o varios electrones desapareados. Los ROS derivados del oxígeno parcialmente reducido son muy tóxicos debido a su alta reactividad. Los ROS se forman en la cadena respiratoria y permanecen en el centro activo de la Citocromo C oxidasa hasta que llegan los electrones restantes para continuar la reducción. Con la llegada del cuarto electrón, se forman dos moléculas de agua, reduciendo completamente el oxígeno.

• El oxígeno reacciona con un electrón procedente de la ubiquinona parcialmente reducida (entre los complejos I y III) y se forma el anión superóxido.
• El anión superóxido (O₂^–) reacciona con el segundo electrón, formando O₂^2-, que se protona fácilmente y forma peróxido de hidrógeno (H₂O₂).
• El peróxido de hidrógeno reacciona con el tercer electrón y se fragmenta, generando el radical hidroxilo (HO^·) y el ion hidroxilo (OH^–).
• La llegada del cuarto electrón reduce completamente al oxígeno y se forma una molécula de agua.

Estos tres ROS (O₂^–, H₂O₂, HO^·) permanecen en el centro activo. Allí, el cuarto electrón reacciona con el radical hidroxilo para formar la segunda molécula de agua. Estos ROS pueden escaparse de la cadena respiratoria, por lo que las mitocondrias son la principal fuente de especies reactivas del oxígeno. La alteración de la función mitocondrial afecta la cadena respiratoria, aumentando la formación de ROS, a veces de forma excesiva.

Además de las especies formadas en la mitocondria, hay otras que se forman por la alteración del oxígeno:

• El oxígeno molecular (O₂) puede romperse por las descargas eléctricas de las tormentas, formando ozono (O₃).
• La excitación de otras moléculas que emiten energía de radiación al oxígeno forma el singlete de oxígeno (¹O₂).

El agente más dañino es el radical hidroxilo (HO^·). El radical superóxido también es muy reactivo, pero su baja liposolubilidad le impide difundir a través de las membranas celulares. Sin embargo, el superóxido puede reaccionar fácilmente con el peróxido de hidrógeno en una reacción no enzimática llamada Reacción de Haber-Weiss, formando oxígeno molecular, agua y el radical hidroxilo.

El radical hidroxilo también puede formarse por otra reacción no enzimática, la Reacción de Fenton, a partir del peróxido de hidrógeno. Este atrae fácilmente a los metales de transición, produciéndose la transferencia de un electrón de estos metales al peróxido de hidrógeno. Este se fragmenta, dando lugar al radical hidroxilo y al ion hidroxilo. Si el metal de transición es el hierro, este pasa de Fe²⁺ a Fe³⁺.

El radical hidroxilo también se puede formar mediante radiación ionizante, que fragmenta el agua en un átomo de hidrógeno y un radical hidroxilo.

El peróxido de hidrógeno no es un radical libre por no tener electrones desapareados, pero se incluye en el grupo de los ROS porque forma fácilmente el radical hidroxilo, siendo un oxidante menos potente que este último.

Efectos de los ROS en las Biomoléculas

El H₂O₂, a través de reacciones ionizantes, genera el radical hidroxilo, que reacciona con el ADN del núcleo y de las mitocondrias. Esto provoca la apertura de los anillos del ADN, desestabilizando la molécula y separando las hebras. El radical hidroxilo también es responsable de la formación de dímeros de timina junto con la radiación ultravioleta. Además, produce cambios en las bases nitrogenadas, como la transformación de guanina en 8-hidroxiguanina u 8-hidroxidesoxiguanina, que se determina en orina para medir la cantidad de ROS en el organismo. Agentes dañinos como el tabaco aumentan hasta en un 50% la cantidad de 8-hidroxidesoxiguanina. Si estos daños en el ADN no se reparan, pueden acumularse en la célula, aumentando la probabilidad de mutaciones y cáncer, siendo este último una consecuencia del estrés oxidativo.

El radical hidroxilo y las especies reactivas del oxígeno en general interaccionan con los ácidos grasos poliinsaturados de los fosfolípidos de las membranas. La oxidación de estos lípidos forma lipoperóxidos, que se fragmentan fácilmente en aldehídos tóxicos, como el malondialdehído (MDA) y el 4-hidroxinonenal (HNE). Estos aldehídos interaccionan con las proteínas de las membranas, formando aductos covalentes y aumentando la permeabilidad de las membranas. Esto provoca una entrada masiva de calcio en la célula, alterando la función mitocondrial y aumentando la producción de ROS. Los agentes oxidantes también actúan sobre las proteínas, provocando la oxidación de aminoácidos como la cisteína, que tiene un grupo azufre libre que se oxida fácilmente. Esto forma puentes disulfuro, desactivando o degradando la proteína. Además, los ROS provocan la despolimerización de las membranas, pudiendo causar la muerte celular.

En la última década se han descubierto otros compuestos reactivos, que son los ROS combinados con nitrógeno (RNOS). El más importante es el óxido nítrico (NO), un radical libre formado a partir de la arginina por la enzima óxido nítrico sintasa. El óxido nítrico, cuando se produce en exceso, se combina fácilmente con el oxígeno, formando peroxinitrito (ONOO^–), muy tóxico en altas concentraciones.

Otras Fuentes de ROS

Los ROS también se producen en lugares diferentes a las mitocondrias, como en los procesos inflamatorios asociados a infecciones bacterianas. Las células fagocíticas producen y liberan ROS para combatir a la bacteria causante de la enfermedad. Los neutrófilos, células fagocíticas móviles del sistema inmunitario, son especialmente importantes en esta función.

Cuando una bacteria se introduce en un tejido, se produce una respuesta inflamatoria aguda. Los neutrófilos migran desde la sangre a la célula infectada, fagocitan la bacteria y forman fagosomas, que se fusionan con los lisosomas para formar fagolisosomas. Este proceso consume gran cantidad de oxígeno, conocido como “estallido respiratorio”, y es catalizado por la NADPH oxidasa. Esta enzima cataliza la reducción de oxígeno a expensas del NADPH, que se oxida a NADP⁺, generando dos moléculas de anión superóxido. Estas se dismutan espontáneamente en presencia de protones, formando H₂O₂ y O₂.

Los neutrófilos utilizan la mieloperoxidasa (MPO), una enzima que usa el H₂O₂ formado para oxidar iones haluros, como los hipocloritos. Esta reacción es espontánea, pero se acelera en presencia de superóxido dismutasa (SOD). Además, el peróxido de hidrógeno reacciona fácilmente con el hierro, oxidándolo de Fe²⁺ a Fe³⁺. El anión superóxido, el singlete de oxígeno, el radical hidroxilo y el hipoclorito atacan a las bacterias fagocitadas, y los fragmentos restantes son degradados por enzimas lisosomales. Estos compuestos, llamados especies reactivas de oxígeno (ROS), también pueden ser liberados accidentalmente, por lo que los neutrófilos son fuentes de ROS.

Otra fuente de ROS son los xenobióticos, a través de la Citocromo P-450 reductasa, que cataliza la transferencia de electrones y forma el anión superóxido. También se pueden formar ROS en los mecanismos de acción de otras enzimas, como la xantina oxidasa y las lipooxigenasas, que catalizan la síntesis de ácido úrico y leucotrienos, respectivamente.

La formación de ROS no es dañina en bajas concentraciones, pero en exceso son tóxicas porque saturan los procesos antioxidantes.

Mecanismos de Defensa Antioxidante

Los sistemas antioxidantes son los mecanismos que tiene el organismo para protegerse de los ROS. Son agentes reductores que inactivan o degradan a los agentes oxidantes, impidiendo o reparando los daños oxidativos provocados por las especies reactivas del oxígeno. Estos mecanismos pueden ser moléculas (sistemas no enzimáticos) o sistemas enzimáticos.

Moléculas Antioxidantes

Glutatión

El glutatión es un tripéptido formado por γ-glutamato, cisteína y glicina. Existen dos formas: reducida (GSH) y oxidada (GSSG). El GSSG está formado por dos moléculas de GSH unidas por un puente disulfuro. El glutatión es esencial para las células, ya que reacciona fácilmente con los agentes oxidantes a través de sus grupos sulfhidrilo, protegiendo a las proteínas. La glutatión peroxidasa cataliza la reacción en la que el glutatión transforma el H₂O₂ en dos moléculas de H₂O, consumiendo dos moléculas de GSH y formando una de GSSG. La glutatión reductasa, usando NADPH como coenzima, regenera el GSH a partir del GSSG en una reacción prácticamente irreversible. El NADPH proviene de la vía de las pentosas fosfato. En condiciones normales, la relación GSH/GSSG es de 500:1. El glutatión también mantiene el hierro de la hemoglobina en estado ferroso y la estabilidad de la membrana de los eritrocitos.

α-Tocoferol

El α-tocoferol es una forma de vitamina E que ejerce su acción antioxidante en entornos lipídicos, como membranas biológicas y lipoproteínas, debido a su liposolubilidad. Su acción antioxidante se debe a que su anillo fenólico atrapa fuertemente los radicales libres, principalmente los derivados de la peroxidación lipídica. Este es un proceso en cadena: por cada ácido graso que se oxida, se forma un radical peroxilipídico que oxida a otro ácido graso adyacente, y así sucesivamente. El α-tocoferol reduce e inactiva los radicales peroxilipídicos, transformándolos en lipoperóxidos, agentes oxidantes menos agresivos que son reducidos por la glutatión peroxidasa. En esta reacción, el α-tocoferol se transforma en radical tocoferoxilo, que se regenera a α-tocoferol en presencia de ascorbato. De esta forma, el α-tocoferol atrapa los radicales libres, impidiendo la peroxidación de los lípidos de las membranas.

Ácido Ascórbico

El ascorbato (una forma del ácido ascórbico o vitamina C, que es hidrosoluble) ejerce su acción en los fluidos extracelulares. La concentración de ascorbato en estos fluidos es muy superior a la de glutatión, por lo que el ascorbato es el principal antioxidante extracelular. Para ejercer su acción antioxidante, el L-ascorbato se transforma en radical ascorbilo y luego en dihidroascorbato. Mediante esta reacción, el ascorbato atrapa las especies reactivas de oxígeno que se forman en el citoplasma, evitando que lleguen a las membranas y, por lo tanto, la peroxidación lipídica. Además, el ascorbato potencia la acción antioxidante del α-tocoferol, ya que este se regenera a partir del radical tocoferoxilo en presencia de ascorbato. El ascorbato se transforma en radical ascorbilo, que se regenera a ascorbato en presencia de GSH.

Otras Moléculas Antioxidantes

• Ácido úrico: Ejerce su acción antioxidante en entornos acuosos. Desde la sangre, reacciona fácilmente con el singlete de oxígeno, el anión superóxido y los peróxidos.

• Melatonina: Hormona formada a partir del triptófano que neutraliza fácilmente los radicales libres.

• β-carotenos: Precursores del retinol (vitamina A) que, al igual que el α-tocoferol, el ubiquinol y la bilirrubina, impiden la peroxidación de los lípidos de las membranas.

Enzimas Antioxidantes

Superóxido Dismutasa (SOD)

Constituyen la primera línea de defensa antioxidante del organismo, protegiéndolo de la toxicidad del anión superóxido. Catalizan reacciones de dismutación, en las que dos moléculas de sustrato idénticas tienen destinos diferentes. En este caso, dos moléculas de anión superóxido reaccionan: una se oxida a oxígeno y la otra se reduce a peróxido de hidrógeno. Esto ocurre en dos etapas: la forma oxidada de la enzima interacciona con una molécula de anión superóxido, reduciéndose la enzima y oxidándose el anión superóxido a oxígeno. La forma reducida de la enzima reacciona con la otra molécula de anión superóxido en presencia de dos protones (H⁺), oxidándose la enzima y reduciéndose el anión superóxido a peróxido de hidrógeno. Estas enzimas son metaloenzimas, y existen varias formas:

• Forma mitocondrial con manganeso.
• Forma citoplasmática con cobre y zinc (las más importantes).

Catalasa

Cataliza la degradación del peróxido de hidrógeno (H₂O₂) en dos moléculas de agua y una de oxígeno. Esta enzima tiene una velocidad máxima y una constante de Michaelis muy elevadas para el H₂O₂, siendo la principal defensa antioxidante frente a este compuesto. Así, el H₂O₂ que se forma constantemente se degrada también constantemente por acción de la catalasa.

Oxidasas

Al igual que las catalasas, se encuentran en los peroxisomas, de manera que el mismo orgánulo celular contiene las enzimas que producen y degradan el peróxido de hidrógeno. La oxidasa impide la formación del radical hidroxilo mediante reacciones de oxidación. Esta enzima es una hemoproteína con cuatro grupos hemo, muy abundante y distribuida en el organismo (sangre, hígado, riñones, médula ósea). Tanto la velocidad de reacción de la superóxido dismutasa como la de la catalasa son muy elevadas, complementándose su acción antioxidante.

Peroxidasas

Catalizan la reducción de los peróxidos utilizando diversos aceptores de electrones (ascorbato, citocromo C), reduciendo e inactivando los peróxidos. La glutatión peroxidasa es la peroxidasa más abundante, y reduce los peróxidos a expensas de la oxidación del glutatión. Contiene selenocisteína, un residuo de cisteína en el centro activo de la enzima que, en lugar de azufre, tiene selenio. El selenio reduce los peróxidos y se oxida a ácido selénico, que queda unido a la enzima. Una molécula de glutatión reducido (GSH) se une al ácido selénico a través de su grupo sulfhidrilo, liberando una molécula de agua. Otra molécula de GSH ataca el enlace entre el selenio y el azufre, rompiéndolo y formando glutatión oxidado (GSSG). El selenio queda libre en la enzima para comenzar un nuevo ciclo, y las dos moléculas de GSH se unen a través de sus grupos sulfhidrilo, formando una molécula de GSSG. La reacción global es:

ROOH + 2 GSH → ROH + GSSG + H₂O

Si el peróxido es H₂O₂, la reacción global es:

2 GSH + H₂O₂ → GSSG + 2 H₂O

La glutatión peroxidasa se encuentra en las mitocondrias y en el citoplasma, siendo muy eficaz para atrapar los peróxidos que se forman fuera de los peroxisomas.

Factores de Riesgo y Marcadores Bioquímicos del Estrés Oxidativo

El estrés oxidativo se produce cuando hay un desequilibrio entre la formación de especies reactivas de oxígeno (oxidantes) y la capacidad de las células para neutralizarlos a través de los sistemas antioxidantes intrínsecos. Muchos factores pueden producir o agravar el estrés oxidativo: malos hábitos alimenticios, radiación, depresión, alcohol, ansiedad, sedentarismo, contaminación, humo de tabaco, estrés, etc. En todas estas situaciones, aumenta la producción de especies reactivas de oxígeno, que interaccionan con los distintos componentes celulares, produciendo diversas reacciones que, si no se evitan o combaten, dan lugar al estrés oxidativo.

Cuando aumenta la producción de estos compuestos, se agota la capacidad de los sistemas antioxidantes. En situaciones de estrés oxidativo, se observa un fuerte aumento de los lipoperóxidos y de los ROS, acompañado de un descenso de la actividad de las enzimas antioxidantes (catalasa, superóxido dismutasa, peroxidasas, entre otras). Cuando disminuye la acción del glutatión y del resto de las enzimas, los grupos sulfhidrilo quedan sometidos a la oxidación, lo que conduce a la degradación e inactivación de la proteína. La disminución de la concentración de glutatión desprotege los grupos sulfhidrilo frente a los agentes oxidantes, degradando la proteína.

Estos factores pueden afectar a otras partes del organismo, pudiendo causar más de 100 enfermedades diferentes, entre las que destacan el cáncer, enfermedades neurodegenerativas (Parkinson, Alzheimer), enfermedades cardiovasculares (aterosclerosis) y el envejecimiento celular. Por esto, es conveniente ingerir dietas con una concentración adecuada de antioxidantes para prevenir algunas de estas patologías.

Marcadores Bioquímicos del Estrés Oxidativo

Existen marcadores bioquímicos que permiten determinar el estrés oxidativo. Por cada molécula vulnerable a la oxidación, hay un marcador que la identifica:

• La alteración del ADN por estrés oxidativo se mide mediante la determinación de 8-hidroxidesoxiguanosina en la orina.

• La peroxidación lipídica se puede valorar mediante la determinación del malondialdehído (MDA) en sangre, orina o muestras de tejidos. Un aumento de MDA indica peroxidación lipídica y, por lo tanto, estrés oxidativo. Esta valoración se puede completar con la determinación del 4-hidroxinonenal.

• La observación de grupos carbonilo y puentes disulfuro en proteínas indica su modificación por estrés oxidativo.

• La relación GSH/GSSG indica la capacidad antioxidante del organismo. Su alteración es un indicador de estrés oxidativo.

Existen preparados comerciales que permiten determinar fácilmente estos compuestos en un laboratorio de análisis clínicos para diagnosticar el estrés oxidativo.