Síntesis de Nuevas Cadenas de ADN
Síntesis de ADN *in vitro*
En 1956, Arthur Kornberg aisló de la bacteria Escherichia coli una enzima capaz de sintetizar ADN *in vitro*: la ADN polimerasa. Para actuar, la ADN polimerasa necesita:
- Desoxirribonucleótidos-5-trifosfato
- Magnesio (Mg2+)
- ADN
La cadena que está entera será tomada como patrón, y el extremo 3′ de la otra cadena será usado como cebador. La ADN polimerasa es una enzima formada por aminoácidos que está en el núcleo y en las mitocondrias. Puede unir 1000 nucleótidos por minuto y permite la síntesis *in vitro* de ADN a partir de otro ADN. Sin embargo, esta enzima es incapaz de iniciar una cadena *de novo*; solo se limita a añadir nucleótidos al extremo de una cadena, el ADN cebador. Actúa añadiendo nucleótidos al extremo que presenta un nucleótido con su carbono 3′ libre, ya que es incapaz de añadirlos al extremo del nucleótido con su carbono 5′ libre. Así pues, la cadena del ADN tan solo puede crecer en sentido 5′->3′. En una cadena de ADN, el nucleótido que tiene el carbono 5′ libre se considera como primer nucleótido de la cadena, y el que tiene libre el carbono 3′ es el último añadido y al cual se puede añadir otro. La ADN polimerasa actúa de forma que el nuevo filamento sintetizado es antiparalelo y complementario al filamento patrón.
Síntesis de ADN *in vivo*
Los primeros experimentos encaminados a conocer cómo se produce la duplicación del ADN en los seres vivos confirmaron la hipótesis semiconservativa y evidenciaron la existencia de un punto de inicio de la replicación que se propaga en los dos sentidos a partir de allí. Además, dieron lugar a dos nuevas incógnitas: cómo la ADN polimerasa podía sintetizar sin necesidad de cebador, y cómo las dos hebras de la horquilla podían crecer en paralelo, ya que si una lo hacía en sentido 5′->3′, la otra debía de hacerlo en sentido 3′->5′, que es imposible porque ninguna enzima actúa en ese sentido. La explicación a estas dos incógnitas tuvo lugar en 1968, cuando Reiji Okazaki descubrió unos fragmentos constituidos por unos 50 nucleótidos de ARN y unos 1000 o 2000 nucleótidos de ADN, que se llamaron fragmentos de Okazaki. Estos fragmentos son sintetizados al principio por la ARN polimerasa, y después, son continuados por la ADN polimerasa, en dirección 5′->3′, sobre las distintas regiones de la hebra patrón. Después, sin desplazarse del lugar que ocupan, estos fragmentos pierden su porción de ARN que se sustituye por ADN, y permanecen unidos entre sí formando un filamento de ADN, que aparentemente crece en dirección 3′->5′.
El Mecanismo de Duplicación del ADN
Duplicación del ADN en Células Procariotas
Hay una secuencia de nucleótidos en el ADN, llamada origen de replicación, que actúa como señal de iniciación de todo el proceso de duplicación. El proceso se inicia con una enzima llamada helicasa que rompe los puentes de hidrógeno entre las dos hebras complementarias y las separa. Otras enzimas, las girasas, eliminan tensiones y los superenrollamientos que se producen en la molécula al romperse la doble hélice. Las proteínas estabilizadoras (SSB) mantienen la separación de las dos hebras complementarias, y se inicia la formación de la horquilla de replicación. El proceso es bidireccional, es decir, hay una helicasa que trabaja en un sentido y otra que lo hace en sentido contrario. Las dos horquillas de replicación enfrentadas forman las llamadas burbujas u ojos de replicación. Posteriormente, además de las enzimas anteriores, intervienen las ARN polimerasas y las ADN polimerasas. Primero, una ARN polimerasa llamada primasa sintetiza un fragmento corto de ARN formado por unos 10 nucleótidos, llamado cebador (*primer*), que actúa como iniciador. Después, la ADN polimerasa, partiendo del cebador, empieza a sintetizar una hebra de ADN en sentido 5′->3′, a partir de nucleótidos trifosfato. Esta nueva hebra tiene un crecimiento continuo y se llama hebra conductora. Sobre la hebra retardada, que es antiparalela a la anterior, la ARN polimerasa sintetiza unos 40 nucleótidos de ARN en un punto que dista unos 1000 nucleótidos de ADN, y entonces se forma un fragmento de Okazaki. Este proceso se va repitiendo conforme se separan los dos filamentos patrón. Posteriormente, viene otra ADN polimerasa que retira los segmentos de ARN y añade nucleótidos de ADN en su lugar. Finalmente, interviene la ADN ligasa que une los fragmentos de ADN sintetizados.
Duplicación del ADN en Células Eucariotas
El ADN de células eucariotas está asociado a histonas, formando nucleosomas. Se ha observado que, durante la replicación, la hebra que sirve de patrón a la hebra conductora se queda con las histonas y ambas se enrollan juntas sobre octámeros antiguos. La hebra retardada y la que le sirve de patrón se enrollan juntas sobre nuevos octámeros de histonas que llegan a los lugares de replicación para formar nuevos nucleosomas. La longitud del ADN de un cromosoma eucariótico es mayor que el procariótico, y además el proceso es muy lento. Se ha observado que en el ADN de un cromosoma no hay un solo origen de replicación, sino aproximadamente un centenar. En general, se forman unas 100 burbujas de replicación, que se distribuyen irregularmente, por lo que hay regiones con muchas burbujas y regiones con muy pocas.