Descontaminación de Material

La descontaminación es un proceso crucial en microbiología que incluye varias técnicas:

• Desinfección: Elimina microorganismos infectantes y se usa antes de la esterilización.
• Esterilización: Elimina todos los microorganismos, incluidas las esporas.
• Limpieza: Se refiere a la eliminación de residuos o sustancias del material.

Los materiales a descontaminar se clasifican en dos tipos:

1. Material sin riesgo: No ha estado en contacto con microorganismos o solo con microorganismos de bajo riesgo.
2. Material de riesgo: Ha estado en contacto con microorganismos patógenos.

Métodos de Descontaminación

• Físicos: Incluyen métodos térmicos (usando calor) y no térmicos (sin calor).
• Químicos: Uso de desinfectantes.
• Biológicos: Involucran el uso de sustancias producidas por otros seres vivos.

Factores que Influyen en la Muerte Térmica de los Microorganismos

1. La naturaleza del microorganismo y su fase de vida.
2. La cantidad de microorganismos presentes (carga microbiana).
3. La temperatura del tratamiento.
4. El tiempo de actuación del método térmico.
5. Uso de calor seco o calor húmedo.

Calor Directo

1. Flameado: Consiste en exponer directamente el material a la llama de un mechero y dejarlo enfriar antes de su reutilización.
2. Incineración: Consiste en la destrucción de material desechable en hornos crematorios.

Calor Seco

Se realiza a una temperatura elevada (180°C) durante 1-2 horas, provoca la carbonización de la materia orgánica.

Calor Húmedo

1. Pasteurización: Usada principalmente en la industria alimentaria, no en microbiología. Se aplican temperaturas de 62.8°C por 15 minutos. No destruye esporas.
2. Ebullición: El material se sumerge en agua hirviendo a 100°C por más de 10 minutos, no destruye esporas.
3. Tindalización: Consiste en exponer el material a temperaturas de 55-95°C durante 30 minutos, repetido durante tres días.
4. Uperización: Empleada en alimentos, consiste en aplicar 150°C durante 1-20 segundos.
5. Autoclave: Es el método más común en laboratorio. Utiliza vapor de agua a alta presión (100-134°C).

Radiaciones

• Radiación UV (no ionizante): Mantiene la esterilidad de superficies afectando el ADN celular, especialmente durante la replicación.
• Radiación Ionizante:
  • Rayos X: Tienen alto poder de penetración.
  • Rayos γ: Muy letales, la esterilización es rápida, aunque presentan riesgos de salud.

Filtración

Descontamina líquidos y gases reteniendo microorganismos en filtros de poro adecuado. El equipo de filtrado debe estar previamente esterilizado. La eficacia depende del tamaño del poro y la carga del filtro.

Controles de Esterilización

1. Controles Físicos: Sondas y manómetros.
2. Controles Químicos: Cambian de color cuando se alcanza cierta temperatura o tiempo.
3. Controles Biológicos: Involucran la exposición de microorganismos resistentes al tratamiento.

Métodos Químicos

Varios factores influyen en la eficacia de los métodos químicos:

1. Tipo de microorganismo y etapa del ciclo de vida.
2. Concentración del desinfectante.
3. Duración del tratamiento.
4. Temperatura.
5. pH.
6. Presencia de materia orgánica.
7. Accesibilidad del desinfectante al microorganismo.
8. Deterioro del desinfectante con el tiempo.

• Alcoholes (etanol e isopropanol)
  • Actuación: Lesiona la membrana y desnaturaliza proteínas.
  • Efectivo sobre: Bacterias.
  • Inconvenientes: Inflamable.

Métodos Biológicos de Descontaminación

1. Agentes Antimicrobianos: Sustancias que eliminan o inhiben el crecimiento de microorganismos.
2. Microbicidas (Microbicidas): Eliminan las formas vegetativas de los microorganismos, no las esporas.
3. Microbiostáticos: Inhiben el crecimiento de microorganismos sin destruirlos.
4. Microbiosis: Destrucción de las formas vegetativas.
5. Microbiostasis: Inhibición del crecimiento o multiplicación de microorganismos, sin destruirlos.
6. Antibióticos: Inhiben o eliminan otros organismos.
7. Antibiosis: Fenómeno en el cual el crecimiento microbiano es detenido o destruido por sustancias producidas por otro ser vivo.

Actuación de los Antibióticos

Su efectividad depende de su capacidad para inhibir una reacción bioquímica esencial para la vida de la célula bacteriana. Para que un antibiótico sea eficaz, debe llegar al foco infeccioso, penetrar en las bacterias y alcanzar la concentración adecuada dentro de las células. Dependiendo de su efecto, un antibiótico puede ser bacteriostático (inhibe el crecimiento sin matar la bacteria) o bactericida (mata la bacteria).

Antibiograma

El antibiograma es una prueba de sensibilidad que evalúa la actividad antimicrobiana de distintos quimioterápicos (como antibióticos) frente a un microorganismo.

Técnicas Asépticas

1. Trabajar cerca de la llama de un mechero.
2. Uso de lámparas UV.
3. Uso de guantes de plástico.
4. Uso de cabinas de seguridad.
5. Flamear la boca de tubos y matraces.
6. Colocar papel de filtro.
7. Almacenar el material estéril.

Aplicación de Frío

• Refrigeración: Mantiene los alimentos entre 8-0°C sin llegar a congelarlos. Ralentiza de 2 a 3 veces la velocidad de las reacciones químicas.
• Congelación: Temperaturas inferiores a -18°C. Este proceso detiene las reacciones de oxidación e hidrólisis de grasas y desnaturaliza algunos enzimas, aunque otros pueden seguir activos a un ritmo más lento.

Actuación sobre el Contenido de Agua

La reducción del contenido de agua en los alimentos disminuye la velocidad de las reacciones.

Reducción de pH de los Alimentos

La acidificación es un método eficaz para conservar alimentos, y se logra añadiendo sustancias que bajan el pH:

• Ácidos fuertes.
• Ácidos débiles lipofílicos.
• Sales de ácidos débiles.

Aditivos

Para preservar a los alimentos de la acción de los microorganismos se usan los aditivos conservantes, que matan o inhiben el crecimiento de los microorganismos.

Tratamiento con Radiaciones

El tratamiento con radiaciones electromagnéticas (REM) es un proceso físico que expone los alimentos a radiaciones para reducir la carga microbiana. Pueden ser ionizantes o no ionizantes.

• RADAPPERTIZACIÓN: Destruye esporas.
• RADURIZACIÓN: Reduce la carga microbiana general.
• RADICIDACIÓN: Elimina un tipo específico de microorganismo.

Radiaciones UV

Se utilizan para eliminar los gérmenes en la superficie del alimento y en el aire circundante.

Aislamiento de Microorganismos

El objetivo principal es el aislamiento de los microorganismos presentes en la muestra hasta obtener cultivos axénicos, es decir, cultivos compuestos por una sola especie de microorganismo. Si la muestra es un cultivo mixto (con diversas especies), el proceso para obtener un cultivo axénico puede realizarse de dos maneras:

1. Técnica directa: Consiste en tomar una colonia aislada y sembrar el microorganismo en un medio adecuado.
2. Técnica indirecta: Implica hacer resiembras sucesivas hasta obtener colonias aisladas.

Preparación de Inóculos

Este inóculo se obtiene a partir de un cultivo puro o de una muestra real, tomando con un asa estéril una porción de la muestra o una colonia, y suspendiéndola en 5 mL de una disolución diluyente estéril.

Técnicas de Siembra

Cualitativos

• Aislar microorganismos: Por estría o agotamiento.
• Mantener cultivos puros: Dilución, inundación o filtración.
• Pruebas de identificación: Medio líquido; Tubo inclinado.

Cuantitativos

• Efectuar recuentos microbianos: Dilución, inundación o filtración.
• Tasa de crecimiento de M.O: Medio líquido.

Técnicas de Siembra según el Método de Inoculación

Medios Líquidos

La siembra se realiza inoculando el medio líquido estéril utilizando un asa de siembra, hisopo o pipeta.

Medios Sólidos

• Inoculación antes del vertido: Se añade 0.1 mL del inóculo a 25 mL de medio fundido a 45-55°C, se homogeneiza y se vierte en una placa.
• Inoculación en profundidad: El inóculo se coloca en la placa, se agrega medio fundido, se homogeneiza y se deja solidificar.
• Agar de cobertura: Se añade una capa de agar fundido sobre las colonias para limitar su crecimiento y evitar que confluyan.
• Inoculación sobre la superficie del medio (Técnica de Kirby-Bauer): Se distribuye el inóculo uniformemente sobre la superficie usando un hisopo, repitiendo varias veces el proceso para asegurar una distribución adecuada.
• Método de inundación: Se agrega entre 0.5-2 mL de inóculo, se deja secar y luego se incuba.
• Método de extensión con asa Digralsky: El inóculo se distribuye por la superficie de la placa utilizando un asa Digralsky, asegurando una cobertura uniforme.
• Siembra por estría en superficie inclinada: Se siembra mediante un movimiento de zigzag a lo largo de una superficie inclinada para renovar cepas o realizar pruebas bioquímicas.
• Siembra en picadura: El inóculo se introduce en el medio hasta 2-3 mm de profundidad, con el objetivo de obtener un crecimiento localizado.
• Siembras por agotamiento: Se dispersa el inóculo sobre el medio en trayectorias largas, separando las células para obtener colonias aisladas.

Incubación

Es el proceso mediante el cual se mantiene un medio de cultivo sembrado en condiciones ambientales controladas para promover el crecimiento de los microorganismos durante un período adecuado.

Temperatura de Incubación

• Psicrófilos: Crecen mejor a bajas temperaturas.
• Mesófilos: Crecen a temperaturas moderadas.
• Termófilos: Prosperan a altas temperaturas.

Composición de la Atmósfera de Incubación

• Aerobios: Requieren oxígeno.
• Anaerobios: Requieren ausencia de oxígeno.
• Microaerófilos: Necesitan oxígeno en concentraciones bajas (2-10%).

Tiempo de Incubación

Varía generalmente entre 24 y 48 horas. El tiempo adecuado depende del microorganismo a cultivar.

Luz

La mayoría de los microorganismos prefieren la oscuridad para su crecimiento.

Humedad Relativa

Conservación de Cultivos

1. Resiembras: Esta técnica consiste en sembrar el microorganismo en un medio fresco, incubar y luego refrigerar. 1-2 meses.
2. Refrigeración: Para prolongar la conservación, se siembra el cultivo en medio sólido en agar inclinado, luego se cubre con aceite mineral estéril y se guarda a 4°C en posición vertical.
3. Congelación: El cultivo bacteriano se mezcla con un agente crioprotector para proteger las células del daño causado por la congelación, y luego se congela a temperaturas de hasta -70°C.
4. Liofilización: Esta técnica es ideal para conservar cultivos durante períodos muy largos. El proceso consiste en agregar un agente crioprotector a la suspensión microbiana, congelarla (usualmente con nitrógeno líquido) y luego someterla a un proceso de liofilización, donde se elimina el agua por sublimación mediante alto vacío. Finalmente, el vial se sella a la llama.

Curvas de Crecimiento Microbiano

El crecimiento de un microorganismo se refiere al proceso en el que el organismo incrementa de manera equilibrada todos sus componentes, lo que conduce a la multiplicación celular y al aumento de la población microbiana. Este proceso de crecimiento microbiano sigue varias fases:

1. Fase de latencia: Es el período inicial tras la transferencia de células a un nuevo medio de cultivo. Durante esta fase, no hay un aumento significativo en la población, ya que los microorganismos necesitan adaptarse al nuevo entorno, producir enzimas y metabolitos intermedios antes de reiniciar su crecimiento.
2. Fase exponencial: Aquí, los microorganismos se multiplican a un ritmo constante.
3. Fase estacionaria: A medida que la población crece, los nutrientes disponibles se agotan y los productos tóxicos se acumulan, lo que reduce el crecimiento.
4. Fase de muerte: Finalmente, debido al agotamiento de reservas celulares y otros factores, las células empiezan a morir sostenidamente. Esto provoca un descenso en la población microbiana.