Reacciones de los Aminoácidos

• Reacción con Ninhidrina: El grupo alfa-amino de los aminoácidos forma complejos coloreados con la ninhidrina: violeta azulado en la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo amino es primario, amarillo para la prolina e hidroxiprolina y café para la asparagina que tiene un grupo amido en la cadena lateral. Esta reacción también identifica los grupos alfa-amino libres presentes en péptidos y proteínas.
• Reacción Xantoprotéica: Los anillos aromáticos presentes en algunos aminoácidos reaccionan con ácido nítrico concentrado formando nitroderivados de color amarillo o anaranjado, por lo cual esta reacción permite reconocer la presencia de Tirosina, Fenilalanina y Triptófano.
• Reacción de Sakagushi: El grupo guanidinio presente en la cadena lateral de la Arginina reacciona con soluciones de alfa-naftol en presencia de Bromo en medio alcalino formando complejos coloreados rosados o rojos.
• Reacción con acetato de Plomo alcalino: Los aminoácidos azufrados como Metionina y Cisteína se reconocen por la formación de precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se forman cuando reaccionan con Acetato de Plomo en medio alcalino.

Métodos de Determinación de Proteínas

Las proteínas son macromoléculas que desempeñan un rol básico en la función y estructura celular. Los análisis de ciertas proteínas y enzimas que circulan en la sangre se emplean extensamente con propósitos de diagnóstico. Existen varios métodos para la determinación cuantitativa de proteínas en los que se destacan el Método de Biuret y el Método de Folin-Lowry.

• Método de Biuret: Es utilizado como método cualitativo y cuantitativo en la determinación de proteínas de materiales biológicos en solución. La reacción consiste en tratar la proteína con sulfato de cobre en ambiente alcalino. El sulfato de cobre, en solución alcalina, reacciona con compuestos que tienen dos o más enlaces peptídicos dando un complejo de coloración violeta. La intensidad del color obtenido es una medida del número de enlaces peptídicos presentes en la solución. El color se debe a la formación de un complejo de coordinación del átomo de cobre y 4 átomos de nitrógeno, 2 de cada cadena polipeptídica. El método de Biuret es reproducible para muchas proteínas, pero requiere de mayor cantidad de proteínas (entre 10 a 20 mg) para la formación del color. El color obtenido de la reacción puede medirse a una longitud de onda de 540 nm.
• Método de Folin-Lowry: Puede ser aplicado tanto a material seco como a soluciones de proteínas. Es un método cuantitativo muy sensible, tanto así que se pueden medir muestras que contengan alrededor de 5 µg de proteínas fácilmente. El color formado por el reactivo de Folin se debe a la reacción de la proteína con el cobre en solución alcalina y la reducción del Cu⁺² a Cu⁺¹ por los residuos de tirosina y triptófano de las proteínas. Los iones cuprosos reducen las sales de fosfomolibdato-fosfotungstato del reactivo, formando un complejo de color azul intenso. La intensidad del color depende del número de aminoácidos aromáticos presentes en la proteína. Sin embargo, debido a que el contenido de estos aminoácidos varía dentro de las proteínas, el color por miligramo de proteína no es constante, sin embargo, el método es muy utilizado para seguir los cambios en el contenido de proteínas durante la purificación de la misma. El color obtenido de la reacción puede medirse a una longitud de onda de 650 nm.

Ácidos Nucleicos

El descubrimiento de los ácidos nucleicos se debe a Meischer (1869), el cual trabajando con leucocitos y espermatozoides de salmón, obtuvo una sustancia rica en carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno y un porcentaje elevado de fósforo. A esta sustancia se le llamó en un principio nucleína, por encontrarse en el núcleo.

Años más tarde, se fragmentó esta nucleína, y se separó un componente proteico y un grupo prostético, este último, por ser ácido, se le llamó ácido nucleico.

En los años 30, Kossel comprobó que tenían una estructura bastante compleja.

En 1953, James Watson y Francis Crick, descubrieron la estructura tridimensional de uno de estos ácidos, concretamente del ácido desoxirribonucleico (ADN).

El ADN está formado por la unión de muchos desoxirribonucleótidos. La mayoría de las moléculas de ADN poseen dos cadenas antiparalelas (una 5´-3´ y la otra 3´-5´) unidas entre sí mediante las bases nitrogenadas, por medio de puentes de hidrógeno. La adenina enlaza con la timina, mediante dos puentes de hidrógeno, mientras que la citosina enlaza con la guanina, mediante tres puentes de hidrógeno.

El ADN es el portador de la información genética, se puede decir por tanto, que los genes están compuestos por ADN.

Extracción de ADN

La extracción de ADN tiene de tres a cuatro pasos:

1. Romper las células, comúnmente conocido como disrupción de la célula o lisis celular, para exponer el ADN. Esto se consigue comúnmente mediante trituración o sonicación de la muestra.
2. Extracción de lípidos de la membrana mediante la adición de un detergente.
3. Extracción de proteínas mediante la adición de una proteasa (opcional pero casi siempre se hace) o el aumento de fuerza iónica.
4. Precipitar el ADN con un alcohol, normalmente etanol o isopropanol helado.

Enzimas: Factores que Afectan su Actividad

Las enzimas son moléculas de proteínas que tienen la capacidad de facilitar y acelerar las reacciones químicas que tienen lugar en los seres vivos, disminuyendo el nivel de la «energía de activación» propia de la reacción. Las enzimas no reaccionan químicamente con las sustancias sobre las que actúan, que se denominan sustrato, ni alteran el equilibrio de la reacción, solamente aumentan la velocidad con que estas se producen, actuando como catalizadores. En general, la velocidad de la reacción enzimática se incrementa con la temperatura hasta que un punto máximo es alcanzado. Este incremento se debe a que aumenta el número de moléculas ricas en energía que pueden pasar la barrera energética de estado de transición, para formar a los productos. La elevación excesiva de la temperatura del medio que contiene a las enzimas, resulta en una disminución de la velocidad como resultado de la desnaturalización, es decir, la pérdida de la estructura tridimensional de las enzimas.

La concentración de H⁺ afecta la velocidad de la reacción en muchas formas. Primero el proceso catalítico usualmente requiere de que la enzima y el substrato tengan grupos químicos en una forma iónica particular para poder interactuar. Por ejemplo, la actividad catalítica puede necesitar a un grupo amino de una lisina en estado protonado (-NH₃⁺) o no protonado (-NH₂⁺), el pH modifica este estado y por tanto a la velocidad de la reacción. pH extremos (altos o bajos) pueden ocasionar la desnaturalización de las enzimas, debido a que la estructura con estos cambios es posible modificar las interacciones iónicas que intervienen en la estabilidad de la enzima en su estado nativo. El pH al cual las enzimas adquieren su máxima actividad es diferente para cada una de ellas y depende de la secuencia de aminoácidos que las conforman, por supuesto, también está relacionado con el microambiente celular en el cual desarrollan su catálisis. Por ejemplo, la pepsina que es una enzima digestiva que actúa en el estómago, posee un pH óptimo de alrededor de 2 unidades, por el contrario otras enzimas que actúan a pH neutro, se desnaturalizan a pH alcalino o ácido. En la mayor parte de las preparaciones la concentración molar real de una enzima no se conoce. En consecuencia, la cantidad de enzima presente sólo puede ser expresada en términos de actividad. Para estandarizar la actividad de una enzima, la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional Bioquímica ha definido una unidad estándar como aquella cantidad de enzima que cataliza la formación de un mol de producto por minuto bajo condiciones de ensayo definidas. La concentración de enzima en una preparación impura se expresa en términos de unidades/mL (U/mL). Las enzimas se sintetizan en la célula y ejercen su acción usualmente en el interior de ellas. Otras enzimas, una vez sintetizadas, salen de las células y funcionan fuera de ellas, por ejemplo, las enzimas del tubo digestivo y las del suero sanguíneo. En este práctico se estudiarán los efectos de factores como pH y temperatura en la cinética de Fosfatasas empleando como sustrato el éster fosfórico, paranitrofenilfosfato de sodio (PNFP). La velocidad de reacción se estimará analizando la aparición de producto paranitrofenol medido espectrofotométricamente. PNFP  PNF + P

Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilación Oxidativa

Es un proceso que se lleva a cabo en la membrana interna mitocondrial y está constituido por una serie de complejos enzima-coenzima de Oxidorreductasas y Ferroproteínas. La actividad del complejo Citocromo C oxidasa puede demostrarse experimentalmente mediante un dador artificial de electrones, la p-Fenilendiamina (pFDH₂), que al reducir al complejo IV de la cadena, cambia de una coloración café clara a café oscura dado que en su forma oxidada es una sustancia muy reactiva que se condensa y polimeriza fácilmente. De esta forma se evidencia el transporte electrónico a través del complejo IV.

El Ciclo de Krebs y la Succinato Deshidrogenasa (SDH)

Es una enzima que se encuentra asociada a la membrana interna de la mitocondria y conecta al Ciclo de Krebs. Oxida al Succinato y produce FADH₂, el cual vuelve a reoxidar generando un flujo de electrones a través de la cadena transportadora de electrones. Es inhibida en forma competitiva con la presencia de ácidos dicarboxílicos como el Malonato, Malato, Oxalacético y Oxálico, los cuales se unen fuertemente al sitio activo de la enzima, lo que genera la acumulación de Succinato. El proceso se puede evidenciar experimentalmente mediante el uso de un aceptor electrónico artificial como el Azul de Metileno, que es coloreado cuando se encuentra oxidado e incoloro cuando se reduce. El transporte de electrones iniciado por Succinato, lleva finalmente a que los electrones sean aceptados por el Azul de Metileno volviéndose esta solución incolora, siempre y cuando la solución esté privada de oxígeno.