Espectroscopía Molecular y Luminiscencia

Espectrometría Molecular de Absorción UV-Vis

4.1.1. Energía Molecular Electrónica. El intercambio de la energía electrónica de átomos y moléculas con radiación electromagnética da lugar a técnicas de absorción y de emisión principalmente en las regiones visible y ultravioleta, pero que, en general, pueden abarcar desde el infrarrojo próximo hasta los rayos X. Los espectros electrónicos resultan mucho más complejos que los espectros de vibración, siendo, generalmente, muy difícil obtener la estructura de las bandas. No obstante, dada la mayor capacidad instrumental de que se dispone en esta región del espectro, su medida es enormemente útil, y encuentran importantes aplicaciones en análisis cuantitativo. El estudio de este tipo de técnicas espectroscópicas se comenzará con la consideración de la energía de los electrones en las moléculas.

4.1.2. Se sabe que numerosas propiedades moleculares como, por ejemplo, frecuencia de vibración, energía de disociación, distancia internuclear, etc., resultan dependientes casi de modo exclusivo de cada par de núcleos en una molécula, sin que el resto de la molécula sea relevante en este aspecto. Esta observación es la que condujo, hace ya tiempo, al concepto químico de enlace. Pues bien, de la misma forma que, en un primer análisis, las propiedades y estructura electrónica moleculares pueden describirse en términos de las energías de sus enlaces, la capacidad de absorción de radiación por parte de las moléculas en la región visible-ultravioleta, puede abordarse a partir de las propiedades de los enlaces aislados. En el desarrollo que sigue, limitaremos nuestras consideraciones al caso de moléculas orgánicas, es decir, moléculas casi exclusivamente constituidas por C, H, O, N, S, P, y algunos otros pocos átomos.

4.1.3. Para poder predecir los estados de energía electrónica moleculares debería resolverse la correspondiente ecuación de Schrödinger: Hψel = Eel ψel, para todos los electrones de la molécula, embebidos en el campo de energía potencial impuesto por los núcleos. Aunque se considere, de acuerdo con la aproximación de Born-Oppenheimer, que los núcleos permanecen estáticos en comparación con el movimiento electrónico, este tipo de cálculo es demasiado complicado para moléculas de pocos electrones e impracticable en cuanto el número de núcleos es un tanto importante. Existen, sin embargo, una serie de afortunadas aproximaciones que han permitido llevar a cabo generalizaciones de mucha utilidad. Por ejemplo, la mayor parte de los electrones de una molécula se encuentran muy localizados alrededor de los núcleos, pudiéndose describir su comportamiento, de forma muy apropiada, mediante los mismos orbitales atómicos de los átomos aislados. Los otros pocos electrones, más deslocalizados, permiten ser descritos por orbitales que engloban, al menos, dos núcleos, denominándose orbitales moleculares. Son estos electrones los que participan en los enlaces químicos y con los que se puede interpretar cualitativamente el comportamiento espectral de la molécula en la región UV-Vis.

4.1.4. En la mayor parte de las moléculas orgánicas, puede considerarse que hay electrones de cuatro tipos: 1) electrones atómicos en capas cerradas, que no participan en los enlaces y que, al poseer elevadas energías de excitación, no contribuyen a la absorción de radiación visible-ultravioleta; 2) Electrones que participan en enlaces covalentes sencillos, como en C-C, C-H, O-H, etc., cuya descripción se puede hacer mediante funciones que admiten el eje internuclear como eje de revolución, denominados orbitales σ. Su energía de excitación es relativamente elevada, por lo que los tránsitos en los que participan estos electrones σ, tienen lugar en el ultravioleta lejano; 3) Electrones no enlazantes, en forma de pares electrónicos en orbitales atómicos de capas incompletas, como por ejemplo, en el O, S, N, los halógenos, etc. A este tipo de electrones se les designa como electrones n y producen absorción de radiación en la región ultravioleta; 4) Electrones que participan en dobles y en triples enlaces, como en C=C, C≡C, C=N, etc., cuya descripción ha de realizarse mediante funciones antisimétricas respecto de un plano, conocidas como orbitales π. La excitación de estos electrones π es la responsable de la mayor parte de la absorción de radiación por parte de la molécula en las regiones visible y ultravioleta.

4.1.5. Tránsitos entre estados electrónicos. Además de los orbitales ocupados, una molécula posee orbitales desocupados o anti-enlazantes. Los estados excitados moleculares pueden describirse haciendo uso de estos orbitales del estado fundamental desocupados, distinguiéndoseles de los anteriores asignándoles un asterisco (*). Se habla, entonces de orbitales sigma-estrella o pi-estrella (σ* o π*). La absorción de luz puede así explicarse, considerando que la molécula cambia el estado energético de un electrón desde un orbital enlazante o no-enlazante a otro anti-enlazante. No obstante, no todos estos tránsitos (transformaciones) son igualmente probables. Mediante ciertas consideraciones de simetría, puede demostrarse que las transiciones permitidas son aquellas en las que los orbitales involucrados son del mismo tipo (figura 1). Según el caso, se las designa como transiciones σ → σ* o π → π*. Con menor probabilidad (menor intensidad de absorción) pueden también observarse tránsitos n → σ* y n → π*. Debido a que la interpretación teórica de estas últimas resulta complicada, es por lo que se a veces se las menciona como transiciones prohibidas.

4.1.6. La disposición relativa de la energía de estos estados es en este orden, menor a mayor energía: σ, π, n (cuyo estado corresponde a la energía de los electrones en orbitales atómicos y, por lo tanto, puede tomarse como cero de energías moleculares), π* y σ*. Las transiciones σ → σ* y n → σ* son, generalmente, las que conllevan mayor cambio en la energía; tienen lugar con radiación correspondiente al ultravioleta lejano (λ inferior a los 200 nm). Debido a que todas las moléculas poseen enlaces sencillos (con orbitales σ),

4.1.6 bis: todas las moléculas presentan algunas transiciones de este tipo, incluso el nitrógeno y el oxígeno del aire, por lo que para llevar a cabo el análisis de esta clase de absorción, hay que trabajar en vacío extremo. La región del ultravioleta lejano se denomina también, por este motivo, ultravioleta de vacío. La experimentación en este caso requiere condiciones muy estrictas, y no suele utilizarse en determinaciones de rutina. Los tránsitos π → π* y n → π* involucran menor cantidad de energía y suelen ocurrir con radiación del ultravioleta próximo y del visible.

4.1.7. La amplia experiencia acumulada acerca de la capacidad de absorción de moléculas orgánicas en la región ultravioleta-visible, pone de manifiesto que algunos tipos de moléculas y grupos funcionales presentan un comportamiento propio, tanto en la localización de las bandas de absorción como en la intensidad de la absorción. Estos hechos pueden utilizarse con fines analíticos para identificar determinadas características estructurales presentes en una determinada especie química. En este contexto, se ha desarrollado cierta terminología especializada para describir estos comportamientos. Así, por ejemplo, se denomina cromóforo a cualquier grupo funcional responsable de absorción de radiación por parte de la molécula a la que pertenece. Lo más general es que los cromóforos sean grupos con uno o varios enlaces múltiples (dobles o triples). El grupo carbonilo o el anillo bencénico, son ejemplos de cromóforos.

4.1.8. Un auxocromo es aquel otro grupo que, sin presentar de por sí capacidad de absorbente, su presencia en la molécula hace incrementar la absorción de radiación por parte de los grupos cromóforos. Generalmente, los auxocromos son grupos que contienen pares electrónicos no compartidos, los cuales interaccionan con la carga electrónica de los grupos cromóforos cercanos. Ejemplos de auxocromos son los grupos -OH, -NH2, etc. En ocasiones, una modificación en las propiedades del medio o bien un pequeño cambio en la estructura molecular producen un desplazamiento de la longitud de onda del máximo de absorción de una banda hacia valores más altos (menor energía en el tránsito); este fenómeno se conoce como efecto batocrómico, o desplazamiento al rojo. El comportamiento contrario se conoce como efecto hipsocrómico o desplazamiento al azul. Cuando un cambio en el disolvente o una pequeña modificación estructural hacen que se incremente la capacidad de absorción de una sustancia (aumento de ε), el fenómeno recibe el nombre de efecto hipercrómico. En el caso contrario se habla de efecto hipocrómico.

Cromóforos Alifáticos

4.3.1. Hay algunas generalizaciones acerca del comportamiento absorbente de las moléculas orgánicas que es importante resaltar. Considérese, en primer lugar, la existencia de enlaces múltiples aislados dentro de una molécula. El factor más importante que determina la localización del máximo de absorción es la naturaleza de la pareja de átomos que forman el enlace (doble o triple). Como puede apreciarse en la Tabla de Cromóforos alifáticos que se presenta al final de esta página, este efecto es mucho más importante en las transiciones n → π* que en las π → π*, lo cual pone de manifiesto la acción directa que el átomo ejerce sobre los electrones n, que no toman parte en el enlace. Otros cambios más relevantes se observan cuando dos o más enlaces dobles se encuentran conjugados en la molécula, por ejemplo: -C=C-C=C-, o -C=C-C=O. Los tránsitos π → π* incrementan, en general, tanto la longitud de onda del máximo de absorción como la capacidad absorbente, al aumentar el número de dobles enlaces conjugados. La acumulación de dobles enlaces conjugados en una molécula hace que la diferencia de energía que separa el orbital π enlazante más energético (HOMO) del orbital π* antienlazante menos energético (LUMO), disminuya al aumentar el número de orbitales π conjugados. Como ejemplo ilustrativo, en la figura se presenta el espectro de β-caroteno.

4.3.2. Asimismo, a modo de ilustración adicional, en el Diagrama 1 se dan los espectros de absorción UV de varios fármacos conteniendo 2, 3, y más dobles enlaces conjugados en su estructura molecular. Puede observarse el efecto batocrómico que el incremento del número de dobles enlaces en la molécula produce en las correspondientes bandas de absorción.

4.3.3. Cromóforos Aromáticos. Los compuestos aromáticos presentan particularidades espectroscópicas propias y diferentes de las sustancias alifáticas. Estas particularidades pueden atribuirse a la alta simetría del grupo bencénico. El espectro del benceno, que es el representante de la serie, se caracteriza por tres bandas de absorción: una primera banda, muy intensa, centrada alrededor de los 170 nm y, por lo tanto, de poca utilidad analítica; una segunda banda, de bastante intensidad de absorción, pero inferior a la anterior, con la que solapa tomando el aspecto de un hombro, centrada alrededor de los 200 nm; y una tercera banda más débil, que fácilmente presenta la estructura fina de los niveles de vibración de la especie excitada, centrada aproximadamente en los 254 nm (figura 2). Estas bandas, afectadas de efecto batocrómico de mayor o menor importancia, resultan características de casi todos los compuestos con grupos aromáticos (véase, por ejemplo, los espectros de fenol y de azobenceno, en la figura 3)

4.3.4. La presencia de sustituyentes en el anillo bencénico desplaza este espectro y generalmente suaviza la estructura fina de vibración. Este comportamiento puede observarse también, en el caso de los hidrocarburos aromáticos policíclicos (naftaleno, antraceno, fenantreno, pireno, etc.), si bien las bandas de absorción se van desplazando cada vez más hacia longitudes de onda más largas, a medida que aumenta el número de electrones π de la molécula. En último término, la absorción de grafito, que es una forma alotrópica del carbono, con estructura laminar constituida por una red de anillos bencénicos fundidos (naturalmente, sin los hidrógenos), abarca ya toda la radiación visible, por lo que la sustancia cobra su característico color negro brillante. Algunas de estas particularidades se exponen en la Tabla de Cromóforos aromáticos.

4.3.5. El comportamiento espectroscópico de las sustancias con actividad farmacológica puede deducirse a partir de los discutido anteriormente. En los Diagramas 1 y 2 se presentan, a modo de ejemplos ilustrativos, algunos de estos comportamientos para diferentes fármacos en cuya estructura contienen algunos de los tipos de cromóforos considerados anteriormente.

4.3.6. Influencia del disolvente. El espectro de absorción de una sustancia en estado gaseoso puede considerarse el espectro genuino de las moléculas aisladas, ya que, debido a las grandes distancias que las separan, la interacción que ejercen entre ellas suele ser muy pequeña. En estas condiciones es posible registrar detalles muy finos de los tránsitos electrónicos e incluso la estructura de los tránsitos a diferentes estados de vibración dentro del estado electrónico excitado. Cuando la sustancia se encuentra, sin embargo, disuelta en un medio líquido, las interacciones soluto-disolvente impiden la libertad de movimientos rotacionales y limitan notablemente los vibracionales, de modo que el resultado es una pérdida de detalles en la estructura fina del espectro de absorción molecular. Este efecto suele ser más importante cuanto más polar es el disolvente. Los disolventes a base de hidrocarburos suelen mostrar más detalles espectroscópicos de las moléculas que los más polares, tal como alcoholes y el agua.

4.3.7. El efecto del disolvente sobre los espectros de absorción permite, además, distinguir entre tránsitos electrónicos del tipo n → π* o π → π*. Los electrones tipo n interaccionan fuertemente con los disolventes polares, los cuales los estabilizan, rebajando su estado energético. El resultado es un incremento en la diferencia de energía que existe entre el estado n y el estado excitado π* con el consiguiente desplazamiento de la longitud de onda del tránsito hacia valores más pequeños (frecuencias mayores), lo que se denomina efecto hipsocrómico. Para los tránsitos π → π*, normalmente ocurre lo contrario, el disolvente estabiliza más al estado excitado, π*, que al estado fundamental, de forma que la diferencia

4.3.7 bis: de energía entre ambos se reduce y la longitud de onda del tránsito se desplaza a valores mayores (frecuencias inferiores). El efecto es del tipo batocrómico.

4.3.8. El cambio del pH del medio puede afectar de forma muy sustancial al espectro de sustancias con propiedades ácido-base. El ejemplo de un indicador ácido-base, cuya disolución cambia de color cuando se modifica la acidez o alcalinidad del medio, ilustra de modo simple este comportamiento. La ionización de las moléculas orgánicas puede destruir o reforzar la conjugación de los dobles enlaces, provocando notables cambios en la forma del espectro de absorción, con desplazamientos en la localización de los máximos de absorción que pueden ser hasta de varias decenas de nm. El estudio de este comportamiento en función del pH proporciona un método específico para la determinación de constantes de disociación ácido-base (pKa). Numerosos compuestos con actividad farmacológica se ven afectados por este efecto.

4.3.10. La región del espectro en el que se pueden observar los tránsitos electrónicos moleculares de los que se ha tratado con anterioridad, abarca parte del infrarrojo próximo (NIR, más o menos la zona entre 1000 y 750 nm), la región visible (vis, de 750 a 400 nm) y la región del ultravioleta próximo (UV, entre 400 y 200 nm). Más allá de 200 nm el aire comienza absorber la radiación de forma notable y el trabajo experimental resulta más complicado.

4.3.11. La fuentes de radiación para la región visible son generalmente lámparas incandescentes, cuyo espectro de emisión abarca también parte del IR. En la región ultravioleta se utilizan lámparas de descarga de deuterio.

4.3.12. Los espectrofotómetros UV-Vis son generalmente de doble haz. La radiación monocromática se bifurca en dos haces que se les hace pasar, uno por la cubeta conteniendo la muestra y el otro por la cubeta que contiene el disolvente, que se conoce como cubeta de referencia, cuya intensidad transmitida se toma como I0. En la práctica se utiliza un único haz de luz que, mediante un sistema de espejos, se le hace incidir alternativamente, en intervalos muy breves de tiempo, sobre cada una de las cubetas.

4.3.13. El monocromador suele ser un prisma dispersor o una rejilla de difracción. Tanto el material del que está construido el monocromador como las ventanas de las cubetas ha de ser lo más transparente a la radiación. En la región visible, el vidrio es un excelente transmisor, pero no lo es suficientemente para la radiación ultravioleta. En longitudes de onda inferiores a los 400 nm se suele utilizar cuarzo

4.3.14. La detección de la radiación visible y ultravioleta se lleva a cabo de forma muy precisa mediante el uso de células fotovoltaicas o dispositivos fotoconductores. La elevada precisión en la medida de la absorbancia que se consigue en este tipo de espectrofotometrías encuentra numerosas aplicaciones en la determinación cuantitativa de sustancias en disolución.

Radiación UV y Piel

4.4.1. A la hora de considerar los efectos biológicos, la región ultravioleta se subdivide en tres subregiones: UV-A, para λ entre 400 nm a 320 nm, UV-B, con λ de 320 nm a 290 nm, y UV-C, de λ < 290 nm, que, aunque son en cierto modo arbitrarias, resultan muy convenientes para considerar el efecto de la radiación UV sobre los organismos vivos. Las regiones UV-B y UV-C representan la parte del espectro biológicamente más dañina pero también la más absorbida por la capa de ozono. La cantidad de ozono que la radiación atraviesa no sólo depende de la concentración de éste en la atmósfera, sino también de la altitud del lugar y del ángulo de inclinación con que se produzca la incidencia.

4.4.2. El efecto nocivo de la radiación solar sobre los organismos vivos puede acotarse si se dispone de una cuantificación del daño producido en función de la longitud de onda. Esta función, conocida como espectro de acción, aunque diferente para cada organismo, es básicamente similar para todos ellos. En el diagrama de la izquierda de la figura 4 se representa la capacidad eritémica, es decir, de producción de enrojecimiento y quemaduras sobre la piel de la radiación solar, a diferentes longitudes de onda. Como se puede observar, el efecto nocivo depende de la longitud de onda, y está muy limitado por debajo de 290 nm, por la escasa capacidad de transmisión de la atmósfera a la radiación UV. La acción de los filtros solares se diseña de forma que contengan sustancias absorbentes con un espectro de absorción que se acomode lo más posible a este espectro de acción relativo. Algunas de estas sustancias son derivados del ácido benzoico, benzofenona, ácido cinámico, etc., cuyo espectro se presenta a la derecha de la figura 4, con fines comparativos.

Luminiscencia

4.5.1 Desexcitación Molecular. Luminiscencia. El fenómeno de absorción de luz por parte de las moléculas, discutido en el capítulo anterior, parece, en la práctica, que no depende del tiempo. Es decir, cuando se registra el espectro de absorción de una muestra de manera repetida en un intervalo corto de tiempo, en general no se observan cambios significativos en la medida de la absorbancia. Este hecho indica que el número de moléculas con capacidad absorbente -las moléculas que pueblan el estado fundamental- permanece sensiblemente uniforme, lo cual sólo encuentra interpretación si se admite que, después de su excitación, las moléculas regresan muy rápidamente del estado excitado al estado fundamental. Pueden existir diversos mecanismos mediante los cuales las moléculas pueden perder la energía de excitación. En todos ellos hay cesión de energía al sistema en forma de energía térmica, proceso conocido como desexcitación no radiativa; sólo en algunos casos otra parte de la energía, previamente absorbida, es liberada en forma de radiación luminosa. A estos procesos se les conoce genéricamente como luminiscencia.

4.5.2. La luz emitida en forma de luminiscencia puede ser ultravioleta, visible o infrarroja, y es emitida por moléculas en estado electrónico excitado. La palabra luminiscencia se refiere en general a la emisión de luz por las sustancias después de sufrir un proceso de excitación que no incluye el aumento de temperatura. En este sentido se diferencia del fenómeno de incandescencia, o emisión de luz caliente. La luminiscencia, o emisión de luz fría, puede clasificarse, según el modo de excitación en: Fotoluminiscencia, Quimioluminiscencia, Bioluminiscencia, Electroluminiscencia, Sonoluminiscencia, Radioluminiscencia, etc. Desde el punto de vista de la determinación cuantitativa de sustancias, nos interesan principalmente los fenómenos de Fotoluminiscencia, en los que el modo de excitación es la absorción de fotones, que a su vez pueden presentarse de dos formas diferentes, fluorescencia y fosforescencia.

4.5.3. Desexcitación No Radiativa. Cuando una molécula absorbe la energía de un fotón y es promovida a un estado electrónico de energía superior, S0 → S1, el proceso ocurre en una escala de tiempos (~ 10-18 s) mucho más corta que la del movimiento de los núcleos (~ 10-12 s), por lo que puede considerarse que el estado excitado, S1, conserva la geometría molecular del estado fundamental, S0, en el momento de la absorción. En la mayor parte de los casos, esta configuración no corresponde al estado de menor energía vibracional del estado excitado, por lo que, al exceso de energía electrónica acumulado en este estado excitado, se suma cierto exceso de energía de vibración. Este exceso de energía vibracional se disipa de forma espontánea en forma de colisiones con las moléculas circundantes; a temperatura ordinaria el proceso puede durar ~ 10-8 s, es decir, unas mil a diez mil vibraciones moleculares.

4.5.4. Durante el curso de la desexcitación vibratoria del estado excitado, S1, puede ocurrir que la molécula adopte una configuración nuclear que corresponda también a otro estado electrónico. La molécula puede entonces cambiar de estado electrónico y pasar al estado S0; se dice que ha tenido lugar una conversión interna, IC. Estas intersecciones pueden ser muy frecuentes en el caso de moléculas poliatómicas, que poseen un gran número de grados de libertad de vibración. Según esto, no es difícil imaginar que, mediante una serie de conversiones internas, una molécula puede regresar al estado fundamental sin emitir radiación. Este fenómeno, impulsado principalmente por las colisiones entre moléculas, resulta muy rápido en fase líquida, incluso a temperatura ambiente.

4.5.5. Fluorescencia. Si la desexcitación no radiativa tiene muy poca probabilidad de producirse, el regreso al estado fundamental de una molécula desde el estado excitado puede realizarse perdiendo parte de la energía en forma de radiación. Este fenómeno se conoce con el nombre de Fluorescencia, si el tránsito tiene lugar entre estados de la misma multiplicidad (tránsito permitido). Aunque el tiempo de vida media del estado excitado es pequeño, del orden de 10-6 – 10-9 s, es, sin embargo, muy grande en comparación con el tiempo que tarda la molécula en perder su energía de vibración, por lo que la emisión de radiación se produce desde el estado de vibración más bajo. Como en el caso de la absorción, la transición desde el estado excitado al estado fundamental es muy rápida y puede que conduzca a la molécula a un estado de vibración excitado, en el estado electrónico fundamental. Este excedente de energía de vibración se disipa también a través de colisiones. El resultado es que la energía que se emite en forma de luz es siempre menor que la energía absorbida, es decir, la frecuencia de la luz emitida en procesos de fluorescencia es siempre menor (longitud de onda mayor) que la de la radiación absorbida.

4.5.6. Fosforescencia. Si el estado excitado cruza su curva de energía potencial con otro estado de distinta multiplicidad (triplete), T1, existe una pequeña probabilidad de que la molécula realice una conversión interna a este estado electrónico de diferente multiplicidad. Se dice, en estos casos, que se ha producido un cruce intersistemas, ISC. El proceso de desexcitación radiativa entre estados de distinta multiplicidad, T1 → S0, si se produce, se conoce como Fosforescencia. Es diferente a la fluorescencia por el hecho de que la emisión de luz, muy impedida en principio, se produce al cabo de un intervalo de tiempo mucho mayor, después de producida la excitación; es decir, el estado excitado, T1, tiene un tiempo de vida media muy superior a S1. A temperatura ambiente y en disolución, predominan los procesos de desexcitación no radiativa desde el estado triplete. En efecto, como el proceso radiativo está tan retrasado, durante este largo intervalo de tiempo, las numerosas colisiones entre las moléculas favorecen la aparición de nuevos cruces intersistema que hace que la desexcitación se realice de modo preferente a través de otros mecanismos, fluorescentes o no radiativos. Por el contrario, a muy bajas temperaturas o en un medio de mayor rigidez (por ejemplo, sólido), es más fácil que se produzcan fenómenos de fosforescencia. En estas condiciones, el tiempo de retardo entre la excitación y la emisión, puede ser de varios segundos, minutos o incluso mayor. Evidentemente, debido a que el estado triplete, T1, tiene menor energía que el correspondiente estado singulete, S1, (regla de Hund), la luz emitida en forma de fosforescencia tiene frecuencia aún menor (longitud de onda superior) que la correspondiente radiación fluorescente emitida por el mismo tipo de molécula.

Espectrofluorimetría

4.6.1. Espectro de Emisión. Los espectros de excitación y de emisión de fluorescencia se registran con un instrumento denominado espectrofluorímetro. La lámpara debe emitir un flujo muy uniforme de fotones, en todo el margen de longitudes de onda que se desee explorar. En la práctica, el espectro de emisión de una sustancia, es decir, la medida de la intensidad de fluorescencia en estado estacionario, IF, a distintas longitudes de onda, λF, se lleva a cabo con excitación previa de la muestra utilizando una radiación, de intensidad incidente, I0, a una longitud de onda, λE, en la que el fluoróforo presente suficiente absorción, IA. El resto de la radiación se considera radiación transmitida, IT: IA = I0 – IT La intensidad de fluorescencia, IF (λF, λE), será proporcional a la intensidad absorbida, IA (λE): IF = K0 · IA donde el parámetro K0 depende de diversos factores, entre los que destacan las particularidades ópticas del instrumento. Por otra parte, la intensidad transmitida puede relacionarse con la intensidad incidente a través de la ley de Lambert-Beer: IT = I0 · 10-(ελC) = I0 · e-ln 10(ελC) donde ε, es la absortividad molar del fluoróforo, l, es el paso óptico de la cubeta, y C, es la concentración. El producto εlC representa la absorbancia a la longitud de onda de excitación. Según las ecuaciones 4.9-4.11, se obtiene: IF = K0 · I0 · [1 – e-ln 10(ελC) ]

4.6.2. Generalmente el factor K0 es desconocido, por lo que el valor de IF se mide en valores relativos y se expresa en unidades arbitrarias. En el caso de que la absorbancia sea pequeña (a pequeñas concentraciones, por ejemplo), el factor exponencial puede aproximarse al primer término de su desarrollo en serie, 1 – e-ln 10(ελC) ≈ ln 10(ελC), con lo que la ecuación 4.12 se reduce a: IF ≈ K0 · I0 · ln 10(ελC) = K1 · C relación que muestra que, a muy bajas concentraciones, la fluorescencia de una disolución es proporcional a la concentración. A concentraciones más elevadas se observan desviaciones de la linealidad marcada por la ecuación 4.13 e, incluso, el comportamiento no sigue estrictamente los establecido por la ecuación más general 4.12, debido, principalmente, a que parte de la radiación emitida es reabsorbida por las propias moléculas de la muestra sin alcanzar el detector.

4.6.3. Espectro de Excitación. La variación de la intensidad de fluorescencia en función de la longitud de onda de excitación, λE cuando la longitud de onda de observación, λF, se mantiene fija, representa el espectro de excitación. Si se recurre a la ecuación 4.13, se comprueba que estas variaciones son proporcionales al valor de la absorbancia, A = εlC, de modo que puede considerarse que el espectro de excitación representa el espectro de absorción. Con fines ilustrativos, en la figura 6 se dan los espectros de absorción y emisión de algunos compuestos con diferente rendimiento cuántico.

4.6.4. Fluoróforos. El comportamiento fluorescente de una molécula está inversamente relacionado con la flexibilidad de su estructura. Cuanto más rígida sea la estructura molecular más difícil será su desexcitación por mecanismos no radiativos y mayor probabilidad existirá de que lo haga mediante emisión de radiación. La abundancia de sistemas electrónicos π (sistemas conjugados) incrementa la rigidez molecular y facilita el comportamiento luminiscente. Este hecho queda de manifiesto al comprobar que la mayor parte de los compuestos fluorescentes contienen grupos aromáticos. Por ejemplo, el naftaleno, antraceno, naftaceno y pentaceno, con dos, tres, cuatro y cinco anillos bencénicos fundidos, emiten fluorescencia ultravioleta, azul, verde y roja, respectivamente. Los tránsitos π → π*, caracterizados por elevados valores de absortividad, dan también elevada intensidad de fluorescencia y notables valores de rendimiento cuántico. Cuando hay heteroátomos en la molécula de forma que los tránsitos del tipo n → π* son los de menor energía, la molécula presenta fluorescencia muy débil, con rendimiento cuántico pequeño. Este caso ocurre en muchos azocompuestos y compuestos carbonílicos.

4.6.5. Existe una gran variedad de moléculas biológicas que contienen grupos fluoróforos. Citaremos sólo algunos ejemplos: Proteínas: El aminoácido más fluorescente es el triptófano, que proporciona cerca del 90 % de la fluorescencia de las proteínas. Su fluorescencia, además, es muy sensible al entorno molecular, por lo que las modificaciones que se observan pueden permitir caracterizar la polaridad del entorno, la unión de ligandos, cambios conformacionales, etc. La tirosina, si bien es muy fluorescente cuando se encuentra como compuesto libre en disolución, su emisión se debilita notablemente cuando forma parte de una proteína. La desnaturalización generalmente se manifiesta con un incremento en la fluorescencia de los residuos de tirosina. Nucleótidos: Los nucleótidos y ácidos nucleicos son, por lo general poco o nada fluorescentes. NADH: NADH es altamente fluorescente, con máximos de absorción y emisión a 340 y 450 nm, respectivamente, mientras que NAD+ no lo es. La fluorescencia es debida al anillo de nicotinamida. Cuando NADH se une a una proteína, su fluorescencia se ve incrementada, hasta cuatro veces. Riboflavina: La riboflavina y los nucleótidos FMN (flavinmononucleótido) y FAD (flavinadeninadinucleótido) tienen su máximo de absorción en 450 nm y emiten a 515 nm.

4.6.6. A menudo se utilizan compuestos extraños a un sistema, pero que poseen elevada fluorescencia, con objeto de que, al interaccionar con las moléculas de la muestra, las modificaciones que se observen en su emisión nos permitan investigar características estructurales que serían inabordables por otros procedimientos. Estas sustancias se denominan sondas fluorescentes.