Fundamentos de la Hibridación de Ácidos Nucleicos

La hibridación es la unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos, mediante la complementariedad de su secuencia de bases nitrogenadas, originando una molécula híbrida bicatenaria. Permite detectar secuencias concretas de dianas o ácidos nucleicos mediante sondas marcadas.

Conceptos Clave

• Secuencia diana: Secuencia concreta de bases nitrogenadas que se pretende detectar en la muestra problema.
• Sonda: Cadena de nucleótidos cuya secuencia de bases nitrogenadas es complementaria a la secuencia diana.

Las diferentes técnicas de hibridación se diferencian por:

• Tipo de ácido nucleico que se pretende detectar.
• Tipo de sonda que se va a usar.
• Tipo de marcaje que se va a usar.
• Medio o soporte en el que se va a realizar.

Desnaturalización y Renaturalización del ADN

Desnaturalización: Propiedad del ADN consistente en la separación de las dos cadenas de una molécula bicatenaria por ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias. Se consigue aumentando la temperatura o el pH.

Curva de fusión: Representación gráfica de la absorbancia (a 260 nm) de una solución de ADN bicatenario en función de la temperatura. Presenta tres zonas:

• Zona A: Tramo recto en el que la absorbancia es constante y la temperatura aumenta. ADN desnaturalizado: 0%.
• Zona B: Tramo en el que aumenta la absorbancia a medida que aumenta la temperatura. Se produce la desnaturalización.
• Zona C: La temperatura aumenta, pero la absorbancia está en su valor máximo. ADN desnaturalizado: 100%.

Efecto Hipercrómico: Aumento de la absorbancia a medida que la molécula de ADN se desnaturaliza.

Temperatura de fusión (Tm): Temperatura a la cual la desnaturalización es del 50%. La Tm aumenta con la longitud de la molécula y con el porcentaje de pares de bases Guanina-Citosina (G-C).

Renaturalización: Proceso por el cual las dos cadenas de una molécula de ADN, completamente separadas mediante desnaturalización térmica, vuelven a reasociarse al bajar lentamente la temperatura. La velocidad de renaturalización aumenta con la concentración de cadenas.

Diferencias entre desnaturalización y renaturalización: En la desnaturalización influye la composición de bases y no la concentración, mientras que en la renaturalización ocurre lo contrario.

Fases de la Reasociación

1. Fase de nucleación: Fase lenta en la que secuencias cortas de bases complementarias se aparean por formación de puentes de hidrógeno.
2. Fase de cierre de cremallera: Fase rápida en la que se produce el cierre de las secuencias vecinas.

La velocidad de renaturalización está marcada por la fase de nucleación.

Curvas de Renaturalización

Curva de renaturalización: Se obtiene representando la fracción de ADN renaturalizado frente al logaritmo de Cot (concentración inicial de ADN multiplicada por el tiempo).

• Curva de renaturalización de genomas procariotas: Para grandes moléculas y genomas sin secuencias repetidas, la curva es sigmoide, con un punto medio definible.
• Curva de renaturalización de genomas eucariotas: Para grandes moléculas y genomas con secuencias repetidas, la curva no es sigmoide, sino escalonada, con varios puntos de inflexión.

Factores que Influyen en la Hibridación

• Fuerza iónica de la solución.
• Presencia de agentes desnaturalizantes.
• Porcentaje de bases no complementarias.

Especificidad y Sensibilidad

Especificidad: Capacidad de una sonda para discriminar la secuencia diana con la que tiene que hibridar.

Sensibilidad: Probabilidad de detectar cantidades mínimas del híbrido sonda-diana.

Tipos de Sondas y Marcaje

Según su naturaleza, las sondas pueden ser:

• Sondas de ADN.
• Sondas de ARN.
• Sondas químicas sintéticas de ácidos nucleicos.

Marcaje: Procedimiento para marcar la sonda y poder visualizar el resultado de la hibridación.

Tipos de marcadores:

• Detección directa: Isótopos radiactivos y fluorocromos.
• Detección indirecta: Haptenos.

Métodos de marcaje:

• Desplazamiento de mella (nick translation).
• Cebado al azar o aleatorio (random priming).
• Marcaje terminal.
• Marcaje por PCR.
• Marcaje de sondas de ARN.

Purificación de la sonda: Eliminación de los nucleótidos libres marcados para evitar ruido de fondo. Se utilizan métodos como la cromatografía de exclusión por tamaño (geles) o la cromatografía de adsorción (matrices de lana o vidrio).

Fases de la Hibridación

1. Preparación de la muestra y el soporte.
2. Hibridación.
3. Lavado de post-hibridación (para eliminar híbridos imperfectos).
4. Detección del híbrido.

Tipos de Técnicas de Hibridación según el Medio de Soporte

• En medio sólido: Una de las moléculas (secuencia diana o sonda) se inmoviliza sobre un soporte sólido antes de la hibridación.
• En medio líquido: El híbrido sonda/secuencia diana se forma en solución (normalmente en pocillos de una placa microtiter) y luego se fija a la pared del pocillo para su detección.
• In situ: La hibridación se realiza directamente sobre extensiones citológicas o secciones de tejido. El resultado se analiza con el microscopio, considerando detalles morfológicos.

Comparación de Técnicas en Medio Sólido

Se presenta una comparación de cuatro técnicas en medio sólido en función de: tipo de secuencia, tipo de soporte, hibridación, detección/revelado y aplicaciones.

Comparación de Técnicas de Captura de Híbrido y Tecnología de ADN Ramificado

• Técnicas de captura de híbrido: Forman híbridos de ARN/ADN reconocidos por anticuerpos específicos.
• Tecnología de ADN ramificado: Sistema de amplificación de señal basado en la unión de la secuencia diana a un macrocomplejo de ADN mediante hibridaciones sucesivas.

Ventajas de las Técnicas de Hibridación In Situ (ISH)

• No requieren extracción ni purificación previa de ácidos nucleicos.
• Son rápidas, sencillas y de coste económico moderado.
• Pueden realizarse sobre material fresco, congelado o fijado en parafina.
• Proporcionan información a nivel celular individual en relación con otras células o tejidos.
• Permiten estudios retrospectivos.
• Utilizan sondas no radioactivas de ADN, ARN y PNA (ácido nucleico peptídico).

Comparación de FISH y CISH

• FISH (Hibridación in situ con fluorescencia): Utiliza sondas marcadas con fluorocromos, detectadas con un microscopio de fluorescencia y filtros adecuados. Se usa para células y cromosomas.
• CISH (Hibridación in situ cromogénica): El híbrido se detecta mediante una reacción inmunohistoquímica que produce un producto coloreado, observable con un microscopio óptico convencional. Se usa para tejidos.

Cultivo Celular

El cultivo celular es el conjunto de procedimientos que permiten el mantenimiento *in vitro* de células de organismos pluricelulares, preservando sus características.

Tipos de Cultivos

• Cultivo de órganos: Mantenimiento de un órgano entero o parte de él en la interfase entre un medio de cultivo artificial y una atmósfera controlada.
• Cultivo de explantes: Adhesión de un fragmento de tejido a una superficie (placa o frasco de cultivo) y nutrición con un medio de cultivo.
• Cultivo de células: Se realiza a partir de suspensiones celulares introducidas en un recipiente adecuado con un medio de cultivo, incubándose en condiciones óptimas para la proliferación celular.

Tipos de cultivos de células:

• Cultivo celular primario: Se obtiene disgregando células de un tejido por métodos mecánicos o enzimáticos.
• Cultivo celular secundario: Se obtiene a partir de un cultivo primario u otro secundario mediante un subcultivo o pase, o a partir de una línea celular mantenida en congelación.

Aplicaciones de los cultivos celulares:

• Investigación básica.
• Investigación aplicada.
• Ingeniería de tejidos.
• Estudio con células madre.

Curva de Crecimiento del Cultivo

La curva de crecimiento del cultivo celular presenta tres fases:

1. Fase de latencia (lag): Tramo recto sin pendiente, con cierta concavidad. Corresponde a las primeras 24 horas del cultivo. No hay crecimiento.
2. Fase de crecimiento exponencial (log): Tramo recto con pendiente elevada. Dura 6-7 días, durante los cuales el número de células aumenta hasta el máximo.
3. Fase estacionaria: Tramo recto sin pendiente. A partir de los 6-7 días, el número de células permanece constante.

Formas de Crecimiento

• Crecimiento en monocapa: Las células crecen adheridas a una superficie sólida (plástico o vidrio).
  Etapas de desarrollo:
  1. Adhesión a la superficie.
  2. Proliferación y formación de colonias.
  3. Inhibición por contacto.
• Crecimiento en suspensión: Las células no necesitan adherirse a una superficie para crecer.
  Etapas de desarrollo:
  1. Adaptación al medio de cultivo.
  2. Proliferación en suspensión.
  3. Inhibición por densidad.

Sucesivos Pases a partir de un Cultivo Primario

• Línea celular primaria: Obtenida a partir de un tejido u órgano mediante un cultivo primario, mantenida en cultivo mediante pases seriados durante un tiempo determinado.
• Fase de senescencia: Etapa en la que las células pierden su capacidad de división y el cultivo muere.
• Línea celular continua: Obtenida a partir de un cultivo primario, mantenida en cultivo por tiempo ilimitado mediante pases seriados.

Factores que Intervienen en el Cultivo

• Soporte físico.
• Composición y propiedades del medio de cultivo.
• Atmósfera gaseosa.
• Condiciones de incubación.

Material de Cultivo

• Vidrio.
• Plástico desechable.
• Matrices tridimensionales.
• Microesferas de Sephadex o poliacrilamida.

Diagnóstico Prenatal: Obtención del Cariotipo Fetal

La obtención del cariotipo fetal para diagnóstico prenatal depende de las semanas de embarazo. Se puede realizar mediante:

• Muestra de vellosidades coriónicas: Proyecciones del corion, estructura del embrión humano implicada en la formación de la placenta. Contienen las mismas células que el embrión. La biopsia se toma vía transcervical o transabdominal entre las semanas 10 y 14 de gestación. Ventajas: se realiza en el primer trimestre. Desventajas: contaminación materna, mala calidad de las metafases.
• Muestra de líquido amniótico.

Cultivo de vellosidades coriónicas:

• Cultivo corto: Se cultiva la biopsia entre 24 y 48 horas y luego se disgrega.
• Cultivo largo: Se realiza un cultivo primario de los fibroblastos presentes en las vellosidades coriónicas. Se disgrega la muestra y luego se cultiva.