Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias
Las pruebas bioquímicas determinan la actividad de una vía metabólica de la bacteria (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.
Sirven para detectar propiedades fisiológicas y bioquímicas, debido a que éstas demuestran la existencia de ciertas enzimas en las vías metabólicas, que son reflejo de la expresión de un determinado gen en el DNA bacteriano.
Los microorganismos pueden ser separados e identificados de acuerdo a una gran variedad de razones, tales como:
- Determinación de patógenos responsables de enfermedades infecciosas.
- Selección y aislamiento de cepas de microorganismos fermentativos necesarios para la producción industrial de alcoholes, solventes, vitaminas, ácidos orgánicos, antibióticos e enzimas industriales.
- Aislamiento y desarrollo de cepas microbianas que puedan ser utilizadas para la producción de alimentos y mejoramiento de su sabor como son el yoghurt, quesos y productos lácteos.
- Comparación de actividades bioquímicas con propósitos taxonómicos.
La suma total de todas las reacciones químicas es definida como metabolismo celular.
Las transformaciones bioquímicas que ocurren dentro y fuera de la célula se encuentran gobernadas por catalizadores biológicos llamados enzimas y estas son proteínas muy específicas que realizan sólo una reacción química en el metabolismo de la bacteria.
Las complejas reacciones químicas que debe efectuar un microorganismo son producto de la acción colectiva de grupos enzimáticos, que llevan a cabo la síntesis o degradación de cierto sustrato. Por ejemplo, la oxidación de la glucosa hasta dióxido de carbono y agua es producto de enzimas encargadas de la glicólisis, el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria.
Las enzimas son producidas en la célula, pero de acuerdo al lugar donde efectúan su acción se pueden clasificar en:
Endoenzimas
Son intracelulares y su función está relacionada con las reacciones de degradación y síntesis de sustratos en el interior de la célula (fermentación de los carbohidratos, reacción de la leche tornasolada, producción de sulfuro de hidrógeno, reducción de los nitratos, reacción de la catalasa, test de ureasa, test de oxidasa, test de la coagulasa, hidrólisis de la sangre).
Exoenzimas
Son excretadas a través de la pared celular con el fin de producir los cambios necesarios en los nutrientes del medio ambiente y así permitir el ingreso de éstos a la célula (Hidrólisis del almidón, Hidrólisis de los lípidos, Hidrólisis de la caseína, Hidrólisis de la gelatina).
Pruebas IMVIC: (Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskawer, Utilización de citrato.) Agar tres azúcares de hierro (TSI). Agar hierro lisina (LIA). Fermentación lactosa. Medio movilidad, Indol y Ornitina.
Procedimiento general para la identificación bioquímica
- Cultivar el microorganismo en un medio adecuado, por ejemplo que contenga el sustrato a metabolizar.
- Incubar a una temperatura adecuada.
- Detectar la formación o no de productos degradados o sintetizados.
- Por incorporación en el medio de algún sistema indicador, por ejemplo rojo de metilo.
- Compuesto formado, por ejemplo KOH.
Respiración: Los cambios gaseosos que ocurren dentro de la célula provocan también la liberación de energía.
Involucra fenómenos de oxidación de un sustrato, lo cual ocurre por pérdida de electrones, adición o pérdida de hidrógeno. La forma en que las bacterias captan el oxígeno molecular, se clasifican en aerobios estrictos, anaerobios facultativos y anaerobios estrictos.
Los microorganismos utilizan una gran variedad de compuestos orgánicos, incluyendo carbohidratos. Los polisacáridos, trisacáridos y disacáridos son muy complejos para entrar en la célula bacteriana, por lo que primero son catabolizados a monosacáridos, siendo estos una fuente energética de muchos microorganismos. Las vías y los productos finales de la fermentación dependen del sustrato, de las enzimas presentes y de las condiciones en las que se lleva a cabo la reacción. Las bacterias pueden clasificarse en fermentadores con producción de ácido y fermentadores con producción de ácido y gas.
Algunas bacterias pueden fermentar la glucosa anaeróbicamente, otros la oxidan y algunos microorganismos pueden metabolizarla por ambos mecanismos, mientras otras bacterias son incapaces de utilizarla.
Los productos finales detectables, característicos en una prueba bioquímica relacionada con carbohidratos son:
- ácido láctico
- ácido láctico y fórmico
- ácido láctico y alcohol etílico (etanol)
- acetilmetilcarbinol (acetoína) y dióxido de carbono
- etanol
- ácido succínico —–> ácido propiónico y CO2
- CO2 y acetona a alcohol isopropílico.
Enzimas Intracelulares Asociadas a la Respiración
Catalasa
La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo, excluye el género Streptococcus. Cuando hay oxígeno, se produce la descomposición aerobia de los azúcares. El peróxido de hidrógeno H2O2, si se acumula es tóxico para las bacterias y causa su muerte. Para evitar esto los microorganismos lo descomponen a través de la acción de la enzima catalasa.
Reacción: 2H2O2 catalasa–>2H2O+O2(gas).
Siembra: En una placa el microorganismo. Se añade una gota de agua oxigenada (peróxido de hidrógeno) al 3% y se observa el resultado de la reacción.
Para realizar esta prueba, se utiliza un cultivo de 18 – 24 horas de incubación de Escherichia coli o Staphylococcus aureus.
La prueba positiva produce burbujas, producto del oxígeno liberado. La prueba negativa no de producción de burbujas.
Oxidasa
La oxidasa determina la presencia de la enzima citocromo oxidasa.
La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo que activa la oxidación del citocromo reducido por el oxígeno, el que a su vez actúa como aceptor de electrones en la etapa terminal del sistema de transferencia de electrones.
El oxígeno oxida a un sustrato en la respiración con la intervención del sistema de transporte de electrones. El oxígeno es el aceptor de hidrógenos final, produciendo agua o peróxido de hidrógeno, según la especie.
Todas las especies que producen una enzima oxidasa, cuando se encuentran en presencia de oxígeno atmosférico, citrocromo C y un reactivo de oxidasa, oxidan el reactivo para formar un compuesto coloreado.
Los colorantes son aceptores de electrones artificiales, actúan como reductores del sistema citocromo C oxidasa, el reactivo N,N dimetil, 1,4 fenilendiamina clorhidrato es a la vez aceptor y dador de electrones.
Prueba: Utiliza un papel filtro que se impregna con el reactivo oxidasa en una solución acuosa al 1%, el cual es muy sensible a la luz ya al aire.
El cultivo de los microorganismos debe ser de 18-24 horas, sembrados en agar inclinado. Se toma un inoculo del cultivo y se coloca en contacto con el papel filtro con el reactivo de oxidasa. Utilizar asas de vidrio.
La reacción positiva color violeta oscuro al extender la masa bacteriana sobre el papel de filtro con el reactivo de oxidasa.
La reacción negativa no dará coloración.
Se utilizan los microorganismos Escherichia coli negativo y Pseudomonas aeruginosa positivo para esta reacción.
Fermentación de Carbohidratos
La fermentación de carbohidratos determinará la habilidad de un microorganismo de degradar y fermentar carbohidratos con la producción de un ácido o ácido y gas.
Muchos microorganismos obtienen su energía a través de una serie de reacciones enzimáticas ordenadas e integradas conduciendo a la biooxidación de un sustrato, frecuentemente un carbohidrato. Las vías por lo que este proceso ocurre son:
Respiración Celular
Aeróbica
Biooxidación en que el oxígeno molecular puede servir como aceptor final de electrones.
Anaeróbica
Biooxidación en que iones inorgánicos diferentes del oxígeno, como son NO3-O SO4=, pueden servir como aceptores finales de electrones.
Fermentación
Un proceso biooxidativo que no requiere la presencia de oxígeno y en donde un sustrato orgánico sirve como aceptor final de electrones.
Los microorganismos pueden utilizar los carbohidratos diferencialmente dependiendo de su complemento enzimático.
Algunos microorganismos son capaces de fermentan azúcares como la glucosa anaeróbicamente, donde otros solo pueden utilizar la vía aeróbica. Los microorganismos denominados anaerobios facultativos, son enzimáticamente competentes dado que utilizan ambos procesos el anaeróbico y el aeróbico, encontrándose organismos que carecen de la habilidad de oxidar la glucosa.
La fermentación, sustratos como son los carbohidratos y los alcoholes desasimilados por reacciones de tipo anaeróbicas y produce un ácido orgánico (por ejemplo, ácido láctico, ácido fórmico, o ácido acético) que pueden estar acompañado de gases de hidrógeno o CO2. Los anaerobios facultativos son llamados fermentadores de los carbohidratos. La fermentación es la degradación de la glucosa por la vía de Embdem-Meyerhof, también conocida como vía glicolítica.
La degradación de la glucosa para ver la producción de ácido y gas se lleva a cabo en un tubo de ensayo que contiene en su interior una campana Durham invertida para poder detectar la producción de gas. Un medio típico para ver esta reacción contiene: Ingredientes de un caldo nutritivo que favorecen el crecimiento + Un carbohidrato específico que sirve como sustrato para determinar la capacidad del organismo de producir ácido y gas del la naturaleza crítica de la producción de ácidos a partir de carbohidratos y la actividad del indicador de pH es imperativo que la lectura de esta prueba se efectúe a las 24 horas y no más allá de 48 horas.
Incubaciones extensivas de este análisis pueden producir en el medio elementos alcalinos dada las acciones enzimáticas y dar así una prueba negativa siendo que en cierto margen de tiempo fue positiva.
Reacción positiva color amarillo intenso lo cual indica que el carbohidrato en estudio produjo ácidos que hicieron virar el indicador de un color púrpura intenso inicialmente a uno amarillo. En algunos casos, la producción de ácido se ve con de producción de gas (CO2) que puede ser visible en la campana Durham invertida dentro del tubo.
Reacción negativa Los microorganismos que no son capaces de utilizar el carbohidrato no producen cambios en el indicador de pH, y los tubos aparecen de color púrpura, no hay acompañamiento de producción de gas.
La incapacidad de algunos microorganismos para utilizar los carbohidratos no puede ser considerada como una ausencia de crecimiento en el medio, dado que ellos utilizan otros nutrientes del mismo medio como fuente de energía para crecer.
Nutrientes: Se encuentran las peptonas presentes en el medio. Las peptonas pueden ser degradadas por las enzimas microbianas a aminoácidos que son luego convertidos por desaminación oxidativa en ceto aminoácidos.
Estos son metabolizados a través del ciclo de Krebs para producir energía. Esta reacción libera iones amonio, los que se acumulan en el medio formando hidróxido de amonio (NH4OH) y producir un ambiente de tipo alcalino. Cuando esto ocurre, el púrpura de bromocresol de un color púrpura más intenso es una vía alternativa de respiración.
Caldo nutritivo: Se añade glucosa al 1% más el indicador de pH, el púrpura de bromocresol, es preparado en una solución acuosa aparte al 0,05%. El medio queda de un color azul morado. Se hace lo mismo con otros azúcares tales como lactosa, sucrosa, xilosa, maltosa, etc.
Es importante considerar que los azúcares no se deben mezclar dado que pueden producirse reacciones cruzadas. Luego distribuya el medio a razón de 5 a 7 ml en tubos que contienen en su interior una campana Durham.
Esterilizar: A 121ºC por 10 minutos dado que los azúcares por más tiempo se pueden caramelizar.
Siembra: Cada tubo con los microorganismos problemas como pueden ser por ejemplo Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa además de otros.
Incubar: Los tubos a temperaturas adecuadas durante 24-48 horas, pasado este tiempo realizar la lectura correspondiente.
Medio: Color violeta tendrá pH neutro, el medio color amarillo tendrá pH ácido y el medio azul tendrá pH básico.
Prueba de Óxido / Fermentación
Se llama también prueba de Hugh-Leifson. Se investiga si el microorganismo actúa sobre un azúcar por vía oxidativa o fermentativa.
Medio: Agar nutritivo semisólido más glucosa al 1% y un indicador de pH, púrpura de bromocresol. Se prepara el medio semisólido, se funde al mechero y luego se distribuye en tubos de ensayo a razón de 7 ml por tubo.
Esteriliza: En autoclave por 15 minutos a 121ºC.
El medio neutro tiene un color violeta. El medio ácido tiene color amarillo. El medio básico tiene un color azulado-púrpura.
Antes de sembrar el medio se debe regenerar, el medio se calienta a baño maría hasta ebullición y luego se enfría rápidamente en agua fría con hielo, esto se realiza para extraer todo el oxígeno que pueda contener el medio.
Una vez realizada la regeneración del medio.
Siembra: Los tubos por picadura, con un asa en punta, el microorganismo a estudiar. Se siembran dos tubos, uno de los cuales se cubre con 2 ml de parafina líquida estéril, con el propósito de crear un ambiente anaerobio.
Incuba: A una temperatura de 37ºC durante 24 a 48 horas. Transcurrido este tiempo, se realiza la lectura.
Escherichia coli es un microorganismo fermentativo. Pseudomonas aeruginosa es un microorganismo que no actúa fermentativamente ni oxidativamente sobre la glucosa, dado que no la utiliza como fuente de carbono.
TUBO ABIERTO TUBO CERRADO MECANISMO DE ACCION
Amarillo Violeta Oxidativo
Amarillo Amarillo Fermentativo
Violeta Violeta No actúa
Actividad Enzimático Extracelular
Habilidad de los microorganismos de excretar enzimas extracelulares hidrolíticas capaces de degradar el polisacárido almidón, el lípido tributirina y las proteínas gelatina y caseína.
Debido al tamaño y al alto peso molecular los nutrientes como son los polisacáridos, lípidos y proteínas, estos no son capaces de atravesar la membrana celular. Luego estas macromoléculas tienen que ser hidrolizadas por enzimas extracelulares específicas, a sus componentes más básicos. Estos componentes extracelulares de bajo peso molecular pueden ser transportados al interior de la célula y ser utilizados para la síntesis de requerimientos citoplasmáticos y producción de energía.
Hidrólisis del Almidón
Es una molécula de alto peso molecular, polímero lineal compuesto de moléculas de glucosa unidas a través de enlaces glucosídicos.
La degradación de esta macromolécula primero requiere de la presencia de una enzima extracelular llamada amilasa para hidrolizar a polisacáridos más cortos, llamados dextrinas, y por último a moléculas de maltosa.
La hidrólisis final de este disacárido, que es catalizada por la maltasa, lleva a esta a moléculas de glucosa sustrato de bajo peso molecular, soluble en agua, que puede ser luego transportada dentro de la célula y ser utilizada para la producción de energía para llevar a cabo los procesos de la glucólisis.
El agar almidón es utilizado para demostrar la actividad hidrolítica de la exoenzima amilasa.
Medio: Es agar nutritivo suplementado con almidón, que sirve como sustrato a degradar. El almidón debe ser agregado a una concentración del 1%.
Esteriliza: El medio y luego de enfriado a 50ºC se plaquea en placas estériles, se deja solidificar y luego se seca en la estufa para extraer el exceso de agua de la superficie del agar.
Siembran: Los microorganismos que se le indique en el laboratorio y luego se lleva a estufa a la temperatura adecuada durante 24-48 horas. Pasado este tiempo se realiza la lectura de la prueba agregando lugol directamente a la placa.
La reacción típica del almidón con el lugol es la formación de una coloración azul-pardo.
Un halo incoloro alrededor del inoculo indica la hidrólisis del almidón, y por lo tanto, el microorganismo es amilasa positivo.
Si existe una coloración azul inmediatamente alrededor del cultivo se considera negativa, pues es la reacción típica del almidón que no ha sido hidrolizado por el microorganismo, debido a que no posee la exoenzima.
Hidrólisis de la Gelatina
Aunque el valor de la gelatina como fuente nutricional es cuestionable (dado que es una proteína incompleta, carece del aminoácido esencial triptófano), su valor como prueba de identificación de microorganismos se encuentra bien establecida. La gelatina es una proteína proveniente de la hidrólisis del colágeno, uno de los componentes importantes del tejido conectivo y de los tendones en los humanos y otros animales.
Las proteínas que se producen naturalmente son demasiado grandes para entrar en la célula bacteriana. El catabolismo de las proteínas es un proceso en dos etapas: proteina+ H2O gelatinasa> polipetidos. Polipeptidos+ H2O gelatinasa >aminoacidos.
Medio: Agar nutritivo y se agrega gelatina al 1%. Se funde el medio.
Esteriliza: En autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Una vez esterilizado, se plaquea y deja enfriar.
Siembran: Los microorganismos problemas.
Incuban: A la temperatura adecuada durante 24-48 horas.
La lectura de esta prueba se realiza agregando a la placa el reactivo de Frazier, cuya composición es: HgCl2 15 g ,Hcl concentrado 20 ml Agua destilada 100 ml. Se disuelve el cloruro de mercurio en al ácido y luego se afora a 100 ml con agua destilada. Se filtra si es necesario.
La prueba positiva que indica la presencia de la exoenzima gelatinasa se ve por la presencia de un halo claro en torno al crecimiento del microorganismo.
Si no existe este halo claro la prueba se considera negativa.
Agar Tres Azúcares Hierro (TSI)
Medio diferencial para la identificación de Enterobacterias según la fermentación de tres azúcares (lactosa, sacarosa y glucosa) y producción de ácido sulfhídrico además de gas. Su composición es la siguiente en gramos por litro: Peptona 20. Extracto de levadura 1. Lactosa 10. Sacarosa 10 .Glucosa 1. NaCl 5. Sulfato férrico de amonio 0,3. Tiosulfato sódico 0,42. Rojo fenol 0,0025. Agar 15.
La degradación del azúcar con formación de ácido se detecta por el viraje a amarillo del indicador, mientras que la alcalinización vira a rojo violeta.
Si sólo se degrada la glucosa, la producción de ácido es débil y en la superficie se evapora el dióxido de carbono producido por la oxidación de la glucosa, y el microorganismo utiliza las peptonas, quedando el medio de color rojo violeta y en el fondo en cambio, el medio permanece de color amarillo, debido a que se ha seguido la fermentación de la glucosa, lo que produce ácidos fuertes no volátiles.
Si se degrada la lactosa y la sacarosa, la producción de ácido es intensa, y todo el medio (fondo y superficie) quedan amarillos. La producción de gas se detecta por la formación de burbujas, y eventualmente un agrietamiento del agar.
La producción de ácido sulfhídrico, ya sea a partir del tiosulfato, como de los aminoácidos azufrados de las peptonas, se detecta por la formación de precipitados negros de sulfuro de hiero cuando reacciona el ácido sulfhídrico producido con las sales de hierro del medio.
Medio: Se utiliza en tubos inclinados, con fondo abundante y una cuña corta.
Siembra: En estría en la superficie y picadura en el fondo. Es recomendable utilizar tubos con tapones de algodón para permitir la reoxidación del indicador. Si se utilizan tapones de rosca, estos deben aflojarse para permitir el intercambio gaseoso.
Resultados.
K/A = Superficie alcalina sobre fondo amarillo ácido A/A = Superficie ácida amarilla sobre fondo ácido amarillo R/R = El medio no sufre cambios K/K = Superficie alcalina sobre fondo alcalino
K/R = Superficie alcalina sobre fondo sin cambio
Interpretación. Color y aspecto Fondo Superficie
A amarillo————> fermentación de la glucosa y formación de ácido——-> fermentación de la lactosa y /o sacarosa con producción de ácido.
G aparición de burbujas o grietas—> formación de gas a partir de la glucosa
K rojo intenso————> no se fermenta la glucosa y se produce formación de álcali——-> no hay fermentación de la lactosa y hay formación de álcali.
R no hay cambio de color———-> no hay fermentación de la glucosa——> no hay fermentación de la lactosa ni de sacarosa.
H2S + ennegrecimiento Negro
– negativo
E. coli A(sup incli) A (fondo) -(H2S) +(gas) E. aerogenes A(sup incli) A (fondo) – +K. peneumoniae K(sup incli) A(fondo) – +Proteus sp. K(sup incli) A(fondo) + +S. typhi K(sup incli)A (fondo) + + P.aeruginosa K(sup incli) R (fondo) – –
Agar Hierro Lisina (LIA)
Medio diferencial que permite la identificación de enterobacterias, siendo especialmente útil en la diferenciación de Salmonella y Proteus, se basa en la reacción de descarboxilación del aminoácido lisina, o bien en la desaminación de este aminoácido, y la producción de ácido sulfihídrico.
Medio se encuentra preparado comercialmente por firmas comerciales como Difco y Merck.
Medio: Contiene glucosa (dextrosa), que es rápidamente fermentada por el microorganismo, produciendo acidificación con lo que aparece una coloración amarilla en el medio. En las siguientes horas de incubación los microorganismos que son capaces de descarboxilar la lisina producen alcalinización en el medio, con lo cual el color amarillo que se había formado, se transforma en un color violeta, debido a que el indicador pasa a su forma básica. La producción de ácido sulfhídrico queda evidenciada por la aparición de una coloración negra en el tubo.
Siembran: Los microorganismos a estudiar Proteus y Salmonella por picadura hasta el fondo del tubo y por estría en la superficie de la cuña. Se deja incubar durante 24 horas a 37ºC
Clave.
K = alcalinización (color morado violeta)
A = acidificación (color amarillo)
R = rojo (color rojo, desaminación de la lisina)
+ = sulfatorreductora
– = no reductora del sulfato.
Escherichia coli K superficie K fondo – H2S Salmonella spp. K K +/-Salmonella typhi K K +/-Proteus vulgaris R A +/- Proteus miravilis R A +/-
Pruebas IMVIC
Son un conjunto de cuatro pruebas bioquímicas que sirven para caracterizar bacterias de los diferentes géneros que existen en la naturaleza, como por ejemplo Escherichia coli, Salmonella, Proteus, Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter freundii, etc. Estas cuatro pruebas son Indol, Rojo de Metilo, Voges – Proskauer y Citrato.
Indol
Se determina la capacidad de un microorganismo para producir Indol a partir de la molécula de triptófano, presente en el caldo peptonado, a través de la enzima triptofanasa.
El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar 3 metabolitos indólicos principales: Indol, escatol e indolacético. Diversas enzimas intracelulares que intervienen en este proceso reciben el nombre colectivo de triptofanasa, lo que implica un complejo sistema de enzimas vinculadas a la producción de Indol.
El medio de cultivo para realizar este prueba es agua peptonada (rica en triptófano), la peptona se agrega al 1%.
Se distribuye en tubos de hemólisis a razón de 3 ml y de 5 ml en tubos de ensayo según se utilice y se esteriliza en autoclave durante 15 minutos a 121ºC.
Se siembran los microorganismos problemas y se incuban a la temperatura adecuada durante 48 horas.
La lectura se realiza con el reactivo de Kovacs, cuya composición es la siguiente: +p-dimetilaminobenzaldehido 5 g +Alcohol isoamílico 75 ml +Hcl concentrado 25 ml
Se disuelve el aldehído en alcohol, luego se añade lentamente el ácido. Se filtra si es necesario.
Si se produce Indol, se formará un complejo con el aldehído, de color rojo. El HCl es para favorecer la formación del complejo, que ocurre a pH ácido. El alcohol amílico es para concentrar el color en la superficie del tubo.
Anillo rojo en la superficie del tubo …………………. Indol +
Si no se presenta coloración ………………………….. Indol –
Escherichia coli es Indol +
Enterobacter aerogenes es Indol -.
Prueba del Rojo de Metilo
(RM) se basa en el empleo de un indicador de pH, rojo de metilo, para determinar la concentración de iones hidrógeno presente cuando una bacteria cataboliza la glucosa.
Con esta prueba se investiga si el microorganismo actúa por la vía ácido mixta sobre los azúcares, ésta es una vía metabólica en la que se producen ácidos del tipo fórmico, acético, láctico y succínico (ácidos muy fuertes dentro de la debilidad de los ácidos orgánicos).
Medio de cultivo: Caldo Rojo de Metilo/Voges-Proskauer (RM/VP), cuya composición es la siguiente: Peptona 7 g +Glucosa 5 g +K2PO4 5 g +Agua destilada 1000 ml Este medio es líquido y se prepara y distribuye a razón de 5 ml por tubo de ensayo y se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
La lectura se realiza agregando solución de rojo de metilo, en solución alcohólica al 0,2% (p/v).
Se siembra y se deja incubar por 48 horas, se leen los resultados.
Si el microorganismo ha producido ácidos a partir de la glucosa, se mantendrá rojo el indicador.
Medio ácido indicador rojo RM+
Medio neutro indicador amarillo
naranja. RM-
Escherichia coli es RM +
E. arogenes es RM –
*PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER. La reacción de VP se basa en la detección del acetilmetilcarbinol (acetoína) a partir de le fermentación butanodiólica de la glucosa.
Las bases bioquímicas de la prueba consideran que a partir del ácido pirúvico, una bacteria puede seguir vías metabólicas diferentes para la obtención de energía, según la composición de sus sistema enzimático. Una de estas vías es la fermentación butanodiólica, cuyo producto final es el 2,3 butanodiol, en que la acetoína es su precursor. La prueba de VP se basa en la detección de este último metabolito.
La acetoína que se produce en la fermentación cuando reacciona con el hidróxido de potasio (al 40% p/v) es oxidada a diacetilo, el que a su vez reacciona con los grupos guanidínicos de la arginina, que esta presente en las peptonas que constituyen el medio, dando una coloración rojiza.
Para esta prueba se utiliza el mismo medio que se usa para la prueba del rojo de metilo.
Se siembra el M.o problema y se incuba a 37ºC durante 48 horas.
La lectura se realiza agregando el cultivo 6 a 8 gotas de una solución de KOH al 40% y luego 1 ml de solución alcohólica del alfa naftol al 5% (p/v). Se debe esperar hasta 20 minutos para realizar la lectura, tiempo en el cual se deja en la estufa, el cultivo con los reactivos agregados.
La formación de un anillo rosa fluorescente en la superficie del tubo indica que la prueba es positiva.
Escherichia coli es VP – E. aerogenes es VP +