La caries es una enfermedad infecciosa, transmisible y multifactorial, que conduce a la pérdida de minerales reversible o irreversible de los tejidos duros susceptibles del diente, por acción de productos ácidos provenientes de la fermentación de los hidratos de carbono de la dieta por la actividad metabólica del biofilm adherido a la superficie dentaria (Fontana et al., 2010). La caries dental es un proceso dinámico que se produce por un desequilibrio entre la remineralización y la desmineralización del diente. La participación bacteriana en la etiología de la caries se ha explicado mediante tres hipótesis: la primera es la placa no específica propuesta por Theilade en 1986, la segunda es la placa específica propuesta por Loesche en 1992 y la tercera es la placa ecológica propuesta por Marsh en 1994, siendo esta última la más aceptada (Aas et al., 2008).

Aunque tradicionalmente se ha considerado al Streptococcus mutans como el responsable de la enfermedad, actualmente otras bacterias, denominadas no mutans, se han asociado con el inicio, progresión y actividad de la enfermedad en esmalte, dentina y cemento radicular. Estas se han vinculado con el desequilibrio entre microorganismos acidogénicos y alcalinogénicos en el medio oral, enriqueciendo la diversidad de bacterias involucradas en el proceso de caries dental (Aas et al., 2008). Para profundizar el estudio de la diversidad bacteriana oral asociada a caries dental se han aplicado diversas metodologías, dentro de las cuales destaca el estudio del metagenoma oral. Este nos permite estudiar comunidades bacterianas completas mediante el análisis del DNA, en un determinado ambiente sin necesidad de aislar y cultivar las especies, entregando información sobre la diversidad taxonómica y filogenética de estas comunidades (Belda-Ferre et al., 2012). Este y otros importantes avances que se han alcanzado durante la última década, han contribuido a mejorar la comprensión de la etiopatogenia de la enfermedad y podrían modificar en el futuro el diagnóstico, prevención, manejo y pronóstico de la caries dental. El propósito de esta revisión bibliográfica es exponer los principales resultados que ha aportado el estudio del metagenoma sobre la diversidad microbiana, aplicado específicamente a la comunidad bacteriana oral.

El Proceso de Caries Dental

La caries dental es la enfermedad crónica más frecuente en la especie humana. Su progreso es lento en la mayoría de los individuos, otorgando entre 3 a 4 años para la intervención preventiva antes de la cavitación en lesiones de caries proximales de molares permanentes (Shwartz et al., 1984; Hintze, 2011; Pitts, 1983). La progresión de la lesión puede presentarse desde la pérdida neta de minerales por presencia de ácidos a nivel ultraestructural, hasta la destrucción total del diente. El desarrollo de la lesión de caries es un proceso dinámico con períodos alternados de progresión, detención y regresión (Nyvad et al., 2013), donde la placa dental juega un rol primordial.

La placa dental está definida como una comunidad bacteriana fuertemente adherida a la superficie dentaria, organizada, jerarquizada en sus funciones, adaptable al medio, de cooperación entre microorganismos, activa, clasificada según su localización en supragingival y subgingival. La placa supragingival contiene flora predominantemente Gram positiva, comúnmente asociada a microorganismos cariogénicos (microorganimos acidogénicos y acidofílicos) y la placa subgingival, está compuesta en mayor cantidad de microorganismos anaerobios Gram negativos, que son preferentemente periodontopatogénicos (Seif et al., 1997). Para explicar la participación de las bacterias en la etiología de caries dental se han propuesto tres hipótesis, las que abordan la composición y acción de la placa.

• La hipótesis de la placa no específica postula que la caries se forma mediante la actividad de la placa oral, donde todos los microorganismos que colonizan la superficie dentaria participan por igual en los procesos patológicos, siendo más importante la cantidad que el tipo de especies presentes.
• La hipótesis de la placa específica propone que determinadas especies, como el S. mutans y S. sobrinus están relacionados activamente con la enfermedad, siendo el efecto patogénico de la placa dependiente del tipo específico de microorganismo residente en ella.
• Por último, la placa ecológica postula que la presencia de ciertos patógenos de la placa bacteriana darían origen a enfermedades periodontales y caries dental, pero estaría influenciada por la condición del hospedero y factores ambientales como pH, potencial redox, dieta e higiene (Aas et al., 2008).

Es conocido que la actividad metabólica de la placa dental genera ácidos débiles, que se pueden relacionar directamente con la pérdida neta de minerales. Por ejemplo, en lesiones de esmalte superficial, la placa bacteriana contiene Streptococcus no mutans y Actinomyces, entre otros, que producen un ambiente de acidificación leve, fenómeno compatible con el equilibrio de la desmineralización/remineralización. Además de la producción de ácido, algunas bacterias como S. oralis, S. salivarius y S. gordonii pueden elevar el pH mediante la producción de amonio a partir de urea y arginina (Burne & Marquis, 2000), lo que provee un mecanismo para equilibrar la producción de ácido desde el azúcar ingerido de la dieta, manteniendo así el equilibrio desmineralización/remineralización. Sin embargo, cuando los hidratos de carbono se suministran con frecuencia, la acidificación es moderada, lo que permite que las bacterias no mutans se adapten al medio ácido, produciendo en el tiempo un desequilibrio entre la desmineralización/remineralización, inclinándose hacia la pérdida de minerales que conduce al inicio y progresión de la enfermedad de caries dental.

Bajo prolongadas condiciones ácidas, las bacterias se vuelven más acidúricas, en esta etapa. Los S. mutans y Lactobacilos, así como cepas acidúricas de Streptococcus no mutans, Actinomyces, Bifidobacterias y levaduras pueden llegar a ser dominantes, entre muchas otras bacterias acidógenas y acidúricas. La acidificación del medio ambiente es el principal determinante de los cambios fenotípicos y genotípicos que se producen en la microflora durante la caries (Takahashi & Nyvad, 2011).

En la etapa inicial de la caries (lesión en esmalte) hay un aumento de bacterias tolerantes al estrés ácido y fermentadoras de azúcar, por lo que los determinantes de esta etapa son el pH y la dieta. Sin embargo, en lesiones en dentina hay un aumento de bacterias tolerantes al stress osmótico con actividad colagenasa y proteasa, permitiéndose así la degradación de la dentina, por lo que los determinantes de esta etapa son las bacterias acidogénicas y las bacterias proteolíticas. A partir de esto se ha propuesto que la enfermedad de caries es un proceso en el que las bacterias productoras de ácido son el vehículo para la entrada y penetración del esmalte, permitiendo que las bacterias degradadoras de dentina expandan la cavidad. Por lo que se sugiere que la diversidad bacteriana de la caries varía según su progresión, lo que es indicativo de que la flora bacteriana asociada a la enfermedad es altamente compleja (Simón-Soro et al., 2013a).

Microbioma Oral

La cavidad oral humana está fuertemente colonizada por microorganismos, incluyendo virus, protozoos, hongos, bacterias y arqueas. En contraste con la microbiota que se encuentra en otras partes del cuerpo, que típicamente viven en armonía con el anfitrión, la microbiota normal de la boca es la responsable de las dos enfermedades más comunes del hombre, la caries y la enfermedad periodontal (Wade, 2013).

Las comunidades bacterianas que se encuentran en la boca son muy complejas con participación de alrededor de 1,000 especies (Dewhirst et al., 2010), siendo la segunda más compleja del cuerpo después del colon (Human Microbiome Project Consortium. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature, 2012). Es necesario, por lo tanto, una combinación de análisis (filogenético, metagenómico, transcriptómico, proteómico y metabolómico) para diseccionar completamente las interacciones del microbioma oral, relevantes para la salud y enfermedad.

El conocimiento inicial de la composición del microbioma bacteriano oral tuvo su origen en la microscopía con las observaciones de Leeuwenhoek, quien mostró una colección de diversos morfotipos bacterianos en la placa dental (Wade). Tras el desarrollo de medios de cultivo bacteriano por Koch, Pasteur y otros, la microbiota cultivable de la boca formó una colección diversa de organismos, incluyendo aerobios estrictos, anaerobios facultativos y estrictos, con una amplia gama de potencial metabólico, incluyendo la capacidad de degradar azúcares, proteínas y sustratos complejos derivados de ellos. Este trabajo basado en el ambiente condujo a la identificación de organismos específicos que desempeñaban un papel causal en la caries dental y la periodontitis (Wade). Sin embargo, se ha descrito que una parte sustancial de la vida bacteriana en la tierra no puede ser cultivada en el laboratorio (Amann et al., 1995). En la cavidad oral, por ejemplo, aproximadamente la mitad de las bacterias presentes aún no se han cultivado (Wade). Por lo tanto, estas comunidades bacterianas complejas, han debido ser caracterizadas utilizando diferentes abordajes experimentales.

Métodos de Estudio del Microbioma Oral

Análisis ARNr 16S

Este método se fundamenta en el análisis de secuencias conservadas de genes directamente aislados a partir de muestras de saliva o placa oral, siendo el gen más comúnmente usado para este propósito el que codifica el ARNr 16S (Wade). Esta molécula de ARN corresponde a una subunidad menor del ribosoma procariota, altamente conservado entre distintas especies bacterianas debido a que tiene una tasa de mutación baja, y que además, contiene secuencias hipervariables que proveen de secuencias específicas para cada especie, por lo que es usado como estándar para la clasificación e identificación de bacterias (Nyvad et al.).

Uno de los métodos de estudio del ARNr 16S es la electroforesis en geles denaturantes en gradiente, donde los genes ARNr 16S, con diferentes secuencias tendrán un comportamiento distinto al desnaturalizarse y su movilidad electroforética en el gel, será diferente. Las ventajas de este método es que es económico, fácil de realizar, confiable y excelente para el análisis inicial de la diversidad microbiana en saliva o placa oral. Por otra parte, tiene ciertas limitaciones, la técnica no es cuantitativa, tampoco es posible relacionar las bandas con especies conocidas, y es difícil su comparación con otros geles en muestras que contienen gran número de especies. Li et al. (2007) y Jiang et al. (2011) han utilizado esta técnica para el análisis de la composición de la placa en las diferentes etapas de la caries dental en niños, demostrando que la riqueza y complejidad de especies microbianas disminuye durante el proceso de la caries.

Otro método de estudio del ARNr 16S es el basado en la reacción en cadena de la polimerasa, PCR (Del inglés=Polymerase Chain Reaction). El análisis de muestras de material genético mediante PCR tiene como ventajas que es fácil de realizar y es un método confiable para la detección de patógenos cariogénicos. Como desventaja podemos mencionar que no evalúa otros organismos presentes en las muestras que no puedan ser conocidos por los partidores específicos utilizados. Existen métodos que permiten la evaluación de 3 a 4 patógenos en una reacción (Ciric et al., 2010), e incluso hay otros que permiten identificación de entre 9 a 20 microorganismos (Terefework et al., 2008; Pham et al., 2011), siendo de todas maneras insuficientes para conocer toda la diversidad bacteriana presente en la cavidad oral. Por otro lado, los múltiples ciclos de amplificación pueden afectar la abundancia de los diferentes grupos detectados, alterando la estructura de las comunidades bacterianas asociadas a salud y enfermedad (Xu & Gunsolley, 2014).

Sin embargo, como este método se basa en las regiones hipervariables del ARNr, algunas veces resulta difícil separar especies estrechamente relacionadas debido a la conservación de estos genes y a la alta complejidad de las especies bacterianas en la muestra (Xu & Gunsolley). Usando este abordaje se ha demostrado la asociación entre S. Mutans y S. Sobrinus y caries temprana de la infancia (Choi et al., 2009; Palmer et al., 2010).

Una herramienta útil para la caracterización de comunidades bacterianas es el microarreglo de ARNr 16S. Los microarreglos taxonómicos se han desarrollado para los diferentes tipos de muestras ambientales, donde cada sonda de un gen ARNr 16S es complementaria al de la especie objetivo (blanco). Los genes 16S RNAr presentes en la comunidad microbiana oral son amplificados por PCR, marcados e hibridizados en el microarreglo, por lo tanto este método se puede utilizar para identificar las comunidades bacterianas y conocer la asociación con infecciones orales u otras enfermedades (Call et al., 2003).

Es así como se ha demostrado que la diversidad bacteriana es mayor en individuos sin lesiones de caries, en comparación con individuos con lesiones de caries radiculares y en dentina, donde el Actinomyces y el S. mutans parecieran estar jugando un rol limitado como patógenos de las lesiones de caries radicular (Preza et al., 2009). El uso de esta metodología, permitió al Instituto Forsyth desarrollar el HOMIM (Human Oral Microbe Identification Microarray), base de datos de microarreglos taxonómicos capaz de detectar aproximadamente 300 de las bacterias orales más prevalentes, incluidas algunas que no han podido ser cultivadas. Este método es cuantitativo y las muestras pueden ser dirigidas específicamente a pacientes individuales. La principal desventaja de este método, es que sólo identifica y analiza las bacterias para las cuales se haya preparado el microarreglo taxonómico, no identificando el total de bacterias en la muestra (Nyvad et al.), por lo que no es considerado un método ilimitado (Òopen-endedÓ), a diferencia del pirosecuenciamiento u otros similares.

Para evitar los sesgos inherentes a la aplicación del PCR por sí sola o acoplada a clonamiento y posterior secuenciación, es que se han desarrollado métodos de secuenciamiento de última generación (Next Generation Sequencing= NGS), entre los cuales tenemos: 454 pirosecuenciamiento, Illumina HiSeq/ MiSeq, ABISOLiD y Ion Torrent semiconductor sequencers. Estos análisis permitieron identificar un número mayor de especies bacterianas, y que estas son diferentes dependiendo del sitio de la cavidad oral desde donde se obtuvo la muestra (Aas et al., 2005). Los métodos NGS permiten el secuenciamiento directo del ADN total de una comunidad de bacterias. Las principales ventajas de esta metodología son su alto rendimiento y que no requieren clonamiento, lo que simplifica el procedimiento.

Utilizando esta nueva metodología y con el fin de describir el metagenoma oral en condiciones de salud y enfermedad, Belda- Ferre et al., estudiaron muestras de placa bacteriana de la cavidad oral de individuos sanos y con enfermedad de caries, categorizándolos en libres de caries, tratados por caries y con caries activa. Se tomaron muestras de la placa supragingival de los pacientes y en el caso de pacientes en actividad de caries se tomó una muestra de placa cercana a la lesión y además una muestra de la lesión misma. A pesar del bajo número de muestras examinadas, 25 en total, se encontraron diferencias interesantes en cuanto a la diversidad bacteriana entre individuos sanos y enfermos. En individuos sanos se encontró tendencia a una mayor población de bacilos y Gamma-proteobacterias, mientras que grupos anaerobios son más frecuentes en sujetos enfermos, como los Clostridios y los Bacteroidetes. Los bacilos están particularmente ausentes en las lesiones de caries, y una de las muestras presentó grandes proporciones de Actinobacteria. También se encontró al Aggregatibacter y al

Streptococcus sanguis como uno de los grupos bacterianos más prevalentes en sujetos libres de caries, y se identificó al Streptococcus gordonii y Leptotrihia buccalis como las bacterias más abundantes en sujetos cursando enfermedad de caries. Todo esto sugiere que a pesar que la diversidad bacteriana es muy amplia en la cavidad oral, muy pocos grupos taxonómicos de bacterias representan las grandes proporciones de la microflora oral (Belda-Ferre et al.).

Posteriormente, con el fin de estudiar si la diversidad bacteriana de diferentes sitios de la cavidad oral es representativa de la biodiversidad bacteriana oral, es que Simon-Soro et al. (2013a) analizaron muestras de la superficie bucal y lingual de los dientes y surcos gingivales, dorso de lengua y saliva de dos voluntarios sanos, a través de PCR y pirosecuenciamiento. La información genética recopilada de las muestras se analizó y cuantificó en base a Unidades Taxonómicas Operacionales (Operational Taxonomic Units Ð OTUs), donde cada OTU corresponde a secuencias de nucleótidos de 16S de ARNr agrupadas, las cuales tienen un 97% de similitud entre sí, las cuales permiten estimar un número aproximado de especies bacterianas presentes en la muestra, considerando 1 OTU como una especie bacteriana (Yarza et al., 2008). Los autores muestran diferencias en la composición y diversidad bacteriana entre los diferentes sitios de la cavidad oral, un hecho que es relevante a la hora de la elección del sitio de toma de muestra. Las muestras de saliva y lengua presentaron un mayor número de OTUs con respecto a dientes y surcos gingivales. La superficie lingual de los surcos gingivales mostró el nivel más bajo de OTUs. En las muestras de superficies dentarias y surcos gingivales se encontraron dentro de las especies más representativas los Streptococcus, Veillonella y Fusobacterium. Además se observaron diferencias significativas entre las muestras analizadas de la zona bucal del surco gingival donde predominó el Streptococcus y de la zona lingual del surco gingival donde predominó el Fusobacterium considerablemente sobre el Streptococcus. En superficie dental bucal, los Streptococcus se encontraron entre un 29Ð70% del total de especies bacterianas, en la superficie bucal surco gingival en un 23-57%, en lingual de la superficie dental de un 0-5% y en lingual de surco gingival de un 5-21%.

El amplio rango de estos resultados puede deberse al reducido número de individuos de los cuales se recolectaron las muestras sin embargo, es importante señalar que es el primer trabajo que no utiliza un ÒpoolÓ de muestra de diferentes sitios, sino que los analiza por separado poniendo en evidencia la diversidad según nicho ecológico analizado (Simón- Soro et al., 2013a). Considerando este importante hecho, Simon-Soro et al. (2013b) evaluaron la composición bacteriana comparando individuos sanos versus individuos con enfermedad de caries. Analizaron ADN de muestras de placa dentaria de superficie de esmalte intacto, lesiones de mancha blanca en esmalte y caries dentinaria, y observaron que en esmalte intacto se encontraron 1015 OTUs, en lesiones de mancha blanca en esmalte 193 OTUs y en caries dentinaria profunda 290 OTUs. También se observaron que en las lesiones de esmalte las bacterias S. mutans, S. gordonii, Neisseria, Fusobacterium y Capnocytophaga eran más predominantes. Adicionalmente en las lesiones en dentina superficial, predominaba la familia del Streptococcus y Prevotella, y en lesiones de dentina profunda había un incremento de Lactobacilos, indicando que esta especie no juega un rol central en la iniciación de caries pero si en la progresión de la lesión. En general la cantidad de Streptococcus aumenta a medida que progresa la lesión. Sin embargo, esto no sucede con el S. mutans, que aumenta su proporción en las lesiones de caries, pero aparece en una baja frecuencia y tiende a disminuir a medida que la lesión avanza hacia la dentina (Simón-Soro et al., 2013a).

Como sabemos, el NGS es un proceso más rápido que otros métodos de secuenciamiento y permite analizar una gran cantidad de genes, sin embargo, al ser la última herramienta descrita para análisis genómico aún los softwares se encuentran en desarrollo para la identificación de tan alto número de genes, con el fin de disminuir los errores en la identificación. Las secuencias derivadas pueden ser muy cortas para la identificación a nivel de especies, aunque se puede facilitar la identificación si se compara con muestras específicas de ciertas bacterias. Además presenta ciertas limitaciones, ya que no toma como referencia el fenotipo de la bacteria, ya que la identificación de información genética similar no significa que el fenotipo sea idéntico, y en el proceso de enfermedad y particularmente en el desarrollo de caries la identificación del fenotipo es fundamental. Por esta razón, los nuevos estudios acuñan los conceptos de metaproteoma, metatranscriptoma, y metaboloma para una completa identificación y descripción de las comunidades bacterianas (Nyvad et al.).

Es importante señalar, que por la gran heterogeneidad que poseen los patógenos orales, no se puede confiar solo en la secuencia del 16S RNAr para comprender el grado de cariogenicidad que estos poseen (Gross et al., 2010), ya que tanto el S. mutans, como otros Streptococcus y bacterias de la placa dental, difieren en las características de adherencia, formación de la biopelícula, acidogénesis y la tolerancia al ácido. Todos lo anterior tiene un impacto directo en su capacidad para contribuir en el proceso de caries (Burne et al, 2012). Otra razón de porque la secuencia de 16S RNAr es insuficiente, es el concepto de plasticidad fenotípica. Este se refiere a que las bacterias crecen en función del ambiente en que se encuentran, por lo que el fenotipo puede ser muy diferente (Lemos & Burne, 2008). Los factores ambientales, incluyendo el pH, reacciones oxido-reducción, fuente de hidratos de carbono, densidad de la población y la fase de crecimiento de las bacterias, tiene un gran impacto en la expresión genética de muchos estreptococos orales e influyen en los fenotipos que están directamente relacionados con la cariogenicidad (Burne et al., 2009).

Todos estos métodos tienen por objetivo identificar la información genética para así conformar un metagenoma bacteriano de la cavidad oral, es decir, conjunto de genomas bacterianos que permiten asociar características taxonómicas de las bacterias. Conocer la diversidad microbiana oral otorga información relevante para la actualización de los conocimientos y con esto es posible apuntar hacia nuevos objetivos terapéuticos.