Legislación y Técnicas de Recuento de Microorganismos

1. Legislación sobre el Recuento de Microorganismos en Alimentos y Aguas

Un criterio microbiológico define la aceptabilidad de un producto, un lote de productos alimenticios o un proceso, basándose en la ausencia, presencia o número de microorganismos y/o la cantidad de sus toxinas/metabolitos, por unidad de masa, volumen, superficie o lote.

Se reconocen dos clases de criterios microbiológicos:

• Criterios de seguridad alimentaria: Definen la aceptabilidad de un producto o un lote de productos.
• Criterios de higiene del proceso: Permiten valorar si el funcionamiento del proceso de producción es aceptable o no.

2. Técnicas de Recuento de Microorganismos

El recuento microbiológico, entendido como el conteo de las células individuales por unidad de masa o volumen, es de aplicación a bacterias, levaduras y esporas de hongos. Los mohos, que crecen en filamentos pluricelulares, no pueden ser enumerados, y por ello, se aplican medidas de masa celular.

Se entiende por técnica de recuento microbiano a la determinación cuantitativa de biomasa microbiana, ésta puede incluir tanto células viables (capaces de completar un ciclo de división) como inviables (aun estando vivas en el momento del recuento, no consiguen completarlo).

Existen diversas clasificaciones de los métodos de recuento. En esta ocasión se agrupan según el tipo de cálculo que hay que realizar para obtener el número de células. Según esto, se distinguen:

• Técnicas de recuento directo: Cuando el conteo de células o colonias se relaciona directamente con el número de individuos que existen en la muestra.
• Técnicas de recuento indirecto: Cuando la medida realizada se relaciona con el número de individuos por medio de fórmulas o curvas de calibración.

2.1 Técnicas de Recuento Directo

• Recuento microscópico directo:

  El conteo de las partículas se lleva a cabo de la misma muestra o de una dilución, utilizando el microscopio óptico. La muestra se coloca sobre una cámara cuentaglóbulos. Todas incorporan una cuadrícula de medidas conocidas para facilitar el conteo y la expresión del resultado. El volumen analizado lo constituyen la superficie de la cuadrícula y la altura entre ésta y el cubreobjetos. El resultado se expresa como microorganismo por unidad de masa o volumen. Esta técnica es ventajosa por su rapidez y economía.

  Desventajas:

  • No es capaz de distinguir entre viables y no viables.
  • La cantidad de muestra analizada es muy pequeña.
  • Solo sirve para cargas microbianas superiores a 10,000 células/ml.
  • Las partículas que contiene la muestra pueden confundir al técnico.
  • Produce cansancio visual.
  • La distribución de la muestra sobre la superficie de la cámara puede influir en el resultado.

• Diluciones seriadas:

  El recuento de microorganismos viables se consigue sembrando un volumen conocido (de 0,1 a 1 ml) sobre placas Petri o en tubos de ensayo que contengan un medio de cultivo adecuado para el microorganismo. Generalmente, las muestras se someten a un tratamiento previo de homogeneización que implica una dilución. Este paso es imprescindible en muestras sólidas, y recomendable en líquidas, si se esperan elevadas concentraciones. Normalmente se pesan de 10-25 gramos, se multiplica por 9 el volumen que hay que añadir y se introduce en el homogeneizador de paletas durante el tiempo necesario. Con las muestras líquidas, las diluciones seriadas se realizan de igual forma que con las sólidas. La diferencia estriba en que se puede sembrar directamente 1 ml.

• Recuento en placa:

  De cada tubo se siembra 1 ml o 0.1 ml en una placa. En las siembras en profundidad se coloca en primer lugar 1 ml. Para que el recuento en placa tenga validez estadística, y si se trata de placas Petri de 90 mm de diámetro, hay que contar entre 30 y 300 colonias con el fin de disminuir el error de la medida. En otras ocasiones se siembran, con ayuda del asa de Digralsky, 0.1 ml de cada dilución sobre la superficie del medio solidificado.

• Número más probable (NMP):

  Cuando la concentración de microorganismos en un alimento es muy pequeña, las diluciones seriadas con siembra en placa presentan limitaciones. En una dilución 1/10, la mínima cantidad de colonias contables se encuentran entre 300 y 3,000 ufc/g.

2.2 Técnicas de Recuento Indirecto

El tiempo es uno de los factores que hay que tener en cuenta a la hora de elegir la técnica más adecuada.

• Turbidimetría: Es una técnica que permite determinar la cantidad de luz que es dispersada al atravesar una disolución, para ello se utiliza el nefelómetro. Los métodos de dispersión, por su rapidez, se utilizan para monitorizar el crecimiento de cultivos bacterianos, pero nunca se emplean en técnicas recomendadas, debido al error del resultado. Además, las células que dispersan la luz son tanto viables como no viables. Para realizar un conteo debe hacerse previamente una curva de calibración.
• Peso seco: Se obtiene la concentración celular, de forma muy aproximada, después de filtrar el cultivo a través de una membrana que retiene las células. Posteriormente se seca hasta peso constante. Sus inconvenientes son que no diferencia células vivas de muertas y que el error asociado a la medida es elevado debido a la baja sensibilidad de las balanzas.
• Medida del trifosfato de adenosina (ATP): Solo permite recuento de células viables.
• Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real o cuantitativa (qPCR): Es enormemente sensible y eficiente, además de muy rápida. Es una reacción enzimática in vitro que multiplica millones de veces una secuencia “específica” de ADN. Una variante de la PCR convencional es la cuantitativa, que permite no solo amplificar, sino cuantificar cuánto ADN existe en la muestra de una especie en concreto. El software relaciona la concentración de ADN con el número de células a través de calibraciones. Este software es relativamente sencillo y solo requiere las validaciones adecuadas. Los inconvenientes que presenta son los siguientes: posibilidad de dar falsos positivos por contaminación o fallo en la realización del proceso, inversión en los aparatos y precio de los reactivos.

Microorganismos Marcadores: Índices e Indicadores

1. Definición y Tipos de Marcadores Microbiológicos

Un marcador biológico, físico o químico es un parámetro que informa sobre una cualidad. En microbiología, los marcadores son microorganismos cuyas características los hacen idóneos para evaluar la calidad higiénico-sanitaria. No tienen por qué ser patógenos.

Se distinguen dos tipos de microorganismos marcadores:

• Índices: El índice más conocido es Escherichia coli. Cuando se halla en alimentos se asocia con contaminación fecal.
• Indicadores: Escherichia coli también es un microorganismo indicador y se asocia a una deficiente pasteurización.

Las razones por las que se utiliza un índice o un indicador como parámetro microbiológico, y no el patógeno en sí mismo, son: Epidemiológicas, Ecológicas, Bacteriológicas, Taxonómicas, Metodológicas.

2. Microorganismos Marcadores Específicos

2.1 Microorganismos Viables Aerobios Mesófilos

Son los microorganismos capaces de desarrollarse (viables) en aerobiosis y a temperatura ambiente (20 a 45 ºC). No son muy buenos marcadores. El medio de cultivo utilizado para el recuento microbiológico de bacterias aerobias mesófilas es el agar de recuento en placa (PCA).

2.2 Enterobacterias

La presencia de enterobacterias en alimentos se relaciona directamente con la contaminación fecal. Se trata de bacilos gramnegativos. Dentro de las enterobacterias se distinguen dos grupos: coliformes totales y coliformes fecales. Ambos se caracterizan por fermentar la lactosa. El parámetro conocido como coliformes totales se analiza incubando a 31 ºC; y los coliformes fecales, a 45 ºC. Escherichia coli es un coliforme fecal.

Para la identificación de enterobacterias se utilizan medios de cultivos diferenciales y selectivos. Generalmente, estos medios contienen glucosa o lactosa como hidrato de carbono; sales biliares y cristal violeta, además contiene un indicador ácido-base. El agar MacConkey contiene lactosa como hidrato de carbono; las colonias típicas son rojizas con precipitado violeta como consecuencia de la precipitación de las sales y el cristal violeta; las transparentes son lactosas negativas.

El recuento de enterobacterias puede llevarse a cabo de varias formas, dependiendo del tipo de alimentos y del número esperado:

• Número más probable (NMP)
• Filtración por membrana

2.3 Estreptococos y Enterococos Fecales

En este grupo se incluyen cocos aislados, en parejas o en cadenas cortas, grampositivos. Se consideran índices de contaminación fecal. El medio de cultivo selectivo y diferencial recomendado es agar bilis esculina azida; el cual contiene sales biliares para inhibir la flora grampositiva; azida sódico para inhibir las bacterias gramnegativas y esculina como agente diferencial. Produce un complejo negruzco.

2.4 Clostridium perfringens

Es un bacilo grampositivo. El recuento se realiza por filtración, el m-CP (base de agar), que contiene antibióticos a los que el bacilo es resistente. Tras la incubación en anaerobiosis, las colonias violetas del clostridio pasan a rosa fucsia en vapores de hidróxido amónico.

2.5 Listeria monocytogenes

Es uno de los bacilos grampositivos. Para recuentos, el método más recomendado es el estándar ISO 11290. El procedimiento se inicia con el preenriquecimiento en medio líquido. En agar Oxford, las colonias sospechosas son confirmadas por tinción de Gram.

2.6 Mohos y Levaduras

Se encuentran en el ambiente y es por ello por lo que son buenos indicadores de tratamiento. Además, son indicadores de riesgo de presencia de micotoxinas. Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por hongos como Aspergillus, Fusarium y Penicillium. Son termoestables y muy resistentes a condiciones adversas. Las enfermedades asociadas a la ingesta de mitoxinas se denominan micotoxicosis.

Tabla Resumen de Medios de Cultivo y Condiciones de Incubación