Biotecnología: Fundamentos y Aplicaciones

La biotecnología es toda aplicación tecnológica que utiliza sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación.

Ventajas y Desventajas de la Biotecnología

Ventajas:

• Rendimiento de los cultivos
• Reducción de pesticidas
• Mejor nutrición
• Desarrollo de nuevos materiales

Desventajas:

• Polinización cruzada
• Pérdida de biodiversidad
• Riesgo de fuga en un laboratorio
• Riesgo de transferir toxinas

Aplicaciones de la Biotecnología

Las aplicaciones de la biotecnología abarcan diversos campos:

• Biotecnología en la salud humana y alimentaria
• Biotecnología animal
• Biotecnología industrial
• Biotecnología vegetal
• Biotecnología ambiental

Las áreas más destacadas son: la roja (salud), la blanca (industrial), la verde (agraria), la azul (marina) y la gris (ambiental).

Bioética y Principios Fundamentales

La bioética es la rama de la ética que establece los principios para la conducta humana respecto a la vida y el ambiente.

Los cuatro principios fundamentales son:

• Principio de autonomía: Respeto a las personas para que actúen de forma autónoma.
• Principio de beneficencia: Obligación de actuar en beneficio de otro sin perjuicios.
• Principio de no maleficencia: Abstenerse de causar daño o perjudicar a otros.
• Principio de justicia: Tratar a cada uno como corresponda sin desigualdad.

Laboratorio de Biotecnología y Contención Biológica

Un laboratorio de biotecnología es un espacio exclusivo para el trabajo con técnicas biotecnológicas, diseñado según las buenas prácticas, incluyendo cabinas de transición y sistemas de control de contaminación.

Niveles de Contención Biológica

La contención biológica implica barreras físicas y biológicas para prevenir la diseminación de agentes biológicos peligrosos.

Barreras físicas: Uso de equipamiento especial, instalaciones y procedimientos para prevenir fugas.

Barreras biológicas: Uso de personas inmunes y selección de agentes y hospedadores que minimicen el riesgo de fuga.

Niveles de Contención:

• Nivel 1: Riesgo individual bajo, medidas básicas, agente no peligroso.
• Nivel 2: Riesgo individual moderado, riesgo limitado, agente puede causar enfermedad.
• Nivel 3: Riesgo individual elevado, agente infeccioso por vía respiratoria, infecciones serias y mortales.
• Nivel 4: Riesgo individual y comunitario muy elevado, agente muy infeccioso, sin tratamiento.

Agentes Biológicos

Un agente biológico es un microorganismo con capacidad de producir alergia, infección o toxicidad. Se clasifican en cuatro tipos:

• Tipo 1: Poco probable que cause enfermedad.
• Tipo 2: Puede causar enfermedad, pero existe tratamiento.
• Tipo 3: Produce enfermedad grave, riesgo de propagación, con tratamiento eficaz.
• Tipo 4: Muy peligroso, causa enfermedad grave, sin tratamiento.

Técnicas de Esterilización

La esterilización puede ser por destrucción, separación o inhibición, utilizando métodos como:

• Calor seco o húmedo
• Agentes químicos
• Radiaciones
• Agentes mecánicos
• Filtración
• Desecación
• Presión osmótica elevada
• Baja temperatura

Buenas Prácticas en el Laboratorio

Las buenas prácticas aseguran resultados adecuados, abarcando la organización, los documentos, el personal, la seguridad y las instalaciones.

Prevención de Riesgos en el Laboratorio

Los riesgos se dividen en:

• Riesgo químico: Productos químicos tóxicos.
• Riesgo físico: Radiaciones ionizantes y no ionizantes.
• Riesgo biológico: Virus, parásitos, hongos, cultivos celulares.

Un riesgo biológico es el riesgo de exposición a agentes biológicos que suponen un peligro para el trabajador y el medio ambiente.

Vías de Infección

Las cuatro vías de infección son: vía respiratoria, vía digestiva, vía parenteral y vía dérmica.

Normas de Seguridad en el Laboratorio

Es crucial seguir normas estrictas:

• Usar bata, guantes y gafas de protección.
• Prohibido comer.
• Registrar todo en un cuaderno.
• Evitar movimientos bruscos.

Protección Individual del Trabajador

Incluye la protección de cara y ojos, la protección de la piel y la protección respiratoria.

Tratamiento de Residuos Infecciosos

Un residuo infeccioso es aquel capaz de producir una enfermedad infecciosa. Se debe considerar la presencia y concentración del agente infeccioso, la presencia de un huésped susceptible y la vía de entrada.

Métodos para el tratamiento de residuos:

• Residuos microbiológicos: Autoclave, incineración, descontaminación química.
• Sangre y derivados: Autoclave, incineración, descontaminación química.

Tipos de Métodos

Incineración, autoclave, descontaminación química, inactivación térmica.

Cultivos Celulares

Los cultivos celulares pueden ser de varios tipos:

• Cultivos de órganos: Crecimiento limitado.
• Explantes primarios: Migran y proliferan.
• Cultivos celulares primarios: Monocapa y suspensión (inmortales, crecimiento excesivo, malignas e inestables).
• Cultivos histotípicos y organotípicos: Uno o varios tipos de células.

Biología de las Células en Cultivo

Se establece la selección de células capaces de superar el proceso de disgregación, adhesión y proliferación. Hay dos tipos de crecimiento:

• Crecimiento en monocapa: Células adheridas al sustrato.
• Crecimiento en suspensión: Células capaces de proliferar sin adhesión.

Aplicaciones de los Cultivos Celulares

En la investigación básica: actividad intracelular, ecología celular, flujo interfase celular, interacciones celulares. En la investigación aplicada: biología, biotecnología, inmunología, toxicología.

Proteínas: Estructura y Funciones

Las proteínas son polímeros formados por la unión de aminoácidos mediante enlaces peptídicos. Forman grandes cadenas mediante fuerzas de Van der Waals, puentes de hidrógeno e interacciones. Presentan más de 50 aminoácidos y un peso de 5000 UMA. Son moléculas no lineales que se pliegan, adoptando una forma y función específicas. Su estructura comienza por el extremo N-terminal y termina por el extremo C-terminal.

Estructura de las Proteínas

Hay cuatro niveles de estructura:

• Estructura primaria: Secuencia lineal de aminoácidos ordenada.
• Estructura secundaria: Disposición espacial de los aminoácidos. Tipos: alfa hélice, lámina plegada y hélice de colágeno.
• Estructura terciaria: Disposición de la estructura secundaria. Enlaces: puentes de disulfuro, interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas y fuerzas de Van der Waals.
• Estructura cuaternaria: Solo presente si hay varias cadenas polipeptídicas.

Clasificación de las Proteínas

• Holoproteínas: Constituidas solo por aminoácidos (proteínas fibrosas y globulares).
• Heteroproteínas: Aminoácidos más un grupo prostético (cromoproteínas, glucoproteínas, lipoproteínas, fosfoproteínas y nucleoproteínas).

Propiedades y Funciones de las Proteínas

Propiedades

Dependen de los aminoácidos:

• Solubilidad: Aminoácidos polares en el exterior, apolares en el interior.
• Especificidad: Por función o de especie.
• Desnaturalización: Reversible o irreversible, causada por temperatura, pH o concentración salina.
• Capacidad amortiguadora: Comportamiento anfótero que amortigua el pH.

Funciones

Las funciones de las proteínas pueden ser: función de reserva, función de transporte, función hormonal, función enzimática, función estructural, función homeostática, función de defensa, función contráctil.

Aminoácidos: Componentes Fundamentales

Los aminoácidos son los monómeros de las proteínas. La unión de aminoácidos se denomina enlace peptídico. Si hay de 2 a 10 aminoácidos, se llama oligopéptido; de 10 a 50, polipéptido; y más de 50, proteína. Son moléculas no lineales que se pliegan, adoptando una forma característica que determina su función biológica. Son moléculas pequeñas, cristalinas, solubles en agua, con isomería debido al carbono asimétrico. Hay aminoácidos esenciales (valina, leucina, etc.) y no esenciales (alanina, glicina, etc.). En total, necesitamos 20 aminoácidos para componer las proteínas. Están formados por un grupo amino, un grupo ácido, el carbono alfa y el resto de la cadena. Se clasifican según su ionización, polaridad y reactividad: neutros (polares y apolares), ácidos y básicos.

Propiedades de los Aminoácidos

Son compuestos sólidos, incoloros, cristalinos, algunos con sabor dulce, con un punto de fusión alto, solubles en agua.

Destacan tres propiedades importantes:

• Isomería espacial: Todos tienen un aminoácido asimétrico que se divide en configuración D (grupo amino a la derecha) y configuración L (grupo amino a la izquierda).
• Isomería óptica: Dextrógiro (plano a la derecha) y levógiro (plano a la izquierda).
• Comportamiento anfótero: Pueden ionizarse y comportarse como ácidos o bases.

Debido a esto, los aminoácidos tienden a neutralizar el pH del medio. Si el pH es igual al punto isoeléctrico, se le llama Zwitterion.

Enlace Peptídico

Es un enlace de tipo amida, con carácter parcial de doble enlace. No gira por los elementos C, N, H y O, y tiene polaridad. Cuando se forma un enlace peptídico, también se forma una molécula de agua.

Aislamiento, Purificación y Cuantificación de Proteínas

Extracción de Proteínas

Para elegir el protocolo, se debe tener en cuenta el material de partida (órganos, tejidos o cultivo celular) y la finalidad del extracto, así como si se quiere conservar su actividad biológica.

Métodos de Extracción

• Métodos físicos mecánicos: Agitación con reactivos o homogeneización a elevada presión.
• Métodos físicos no mecánicos: Osmótico o ciclos de congelación-descongelación.
• Métodos químicos: Tratamiento con sustancias alcalinas, solventes, detergentes y ácidos.

Después, se aplican varios pasos para la separación y purificación. La diferencia de tamaño es muy importante, por lo que se han desarrollado varios métodos basados en la alteración de la fuerza de retardo y la velocidad de sedimentación.

Métodos de Diálisis

Separación de moléculas en función de su tamaño mediante membranas semipermeables. Es el paso de las moléculas pequeñas por poros, determinado por la diferencia de concentración y el movimiento browniano.

Filtración

Separación de moléculas de una disolución a través de un material poroso. Se utilizan polímeros de acetato, etc. Cuando el tamaño del poro es muy reducido, se separa por ultrafiltración.

Centrifugación

Separa por tamaño molecular y densidad con un campo gravitatorio. Los diferentes tipos de partículas se separan en función de las características del medio y de las unidades a separar. Esto se conoce como centrifugación diferencial.

Métodos de Separación de Proteínas

Basados en las propiedades químicas de los componentes, así como en aspectos físicos como el tamaño, la forma y la polaridad. Las técnicas físicas aprovechan las diferentes propiedades de las moléculas, como la polaridad, la volatilidad, la solubilidad, la absorción, la carga y el tamaño.

Cromatografía

Engloba las técnicas en las que las moléculas de una mezcla se disuelven en una fase móvil y una fase estacionaria. Hay varios tipos de cromatografía:

• Cromatografía basada en la polaridad:
  • Cromatografía de absorción
  • Cromatografía líquida de alta precisión (HPLC)
  • Cromatografía de intercambio iónico
  • Cromatografía de permeabilidad (cribado molecular)

Electroforesis

Consiste en la migración de partículas cargadas sometidas a la influencia de un campo eléctrico. Tipos:

• Electroforesis en papel de filtro
• Electroforesis en membrana de acetato de celulosa
• Electroforesis en geles de almidón
• Electroforesis en geles de agarosa
• Electroforesis en geles de poliacrilamida
• Electroforesis en geles de SDS-PAGE

Métodos de Cuantificación de Proteínas

Basados en las características diferenciales respecto del resto de biomoléculas presentes en las muestras biológicas. Es la determinación de la cantidad de nitrógeno presente en el enlace peptídico y la formación de complejos con agentes determinados, o en la capacidad de las proteínas para precipitar.

Método de Kjeldahl

Sirve para la determinación de proteínas totales, basado en la determinación del nitrógeno proteico. Se usa en la determinación de proteínas en alimentos, aunque presenta interferencias debido a la presencia de nitrógeno no proteico.

Método de Biuret

Forma complejos de coloración azul con el cobre.

Método de Lowry

Utiliza tres sistemas para producir la coloración en presencia de proteínas: el cobre forma complejos con dos enlaces peptídicos consecutivos, el compuesto reduce el reactivo de Folin y el reactivo de Folin reacciona con los restos de tirosina y triptófano.

Método del BCA

Utiliza el ácido bicinconínico para la determinación colorimétrica de la proteína total de una muestra, pasando de Cu+2 a Cu+1, que presenta una coloración púrpura.

Método de Bradford

Se fundamenta en la unión de las proteínas al colorante azul brillante de Coomassie.

Nefelometría

Cuantificación de proteínas basada en la facilidad que presentan muchas de ellas para precipitar en determinadas condiciones. Cuando la luz choca con la partícula en suspensión, parte de esta se dispersa (turbidimetría).

Métodos de Determinación de Aminoácidos Totales

Los aminoácidos no absorben energía debido a su estructura, con excepción de la fenilalanina, el triptófano y la tirosina. Se utilizan reactivos capaces de reaccionar con los grupos funcionales característicos de estas moléculas.

• Método de la ninhidrina: Permite la determinación de aminoácidos que presenten el grupo amino y carboxilo libres.
• Reacción de Sanger: Reactivo que reacciona en medio básico y da color amarillo.
• Reacción del fenilisotiocianato: Capaz de reaccionar en medio básico con el reactivo de Edman.