Fundamentos y Aplicaciones del Cultivo Celular

1. Fenómenos en la Confluencia del Cultivo Celular

Cuando en el cultivo celular se alcanza la confluencia, el contacto entre las células induce la inhibición del crecimiento. Además, en este estadio, las células muestran propiedades morfológicas y fisiológicas similares a las que exhibirían en el tejido vivo de procedencia.

2. Mecanismos que Regulan la Secuencia en Líneas Celulares

La secuencia en las líneas celulares puede ser regulada de manera espontánea (por exposición a radiaciones ionizantes o compuestos químicos) o de manera inducida (por infección vírica o transfección de ADN).

3. Características de las Células Meristemáticas

Las células meristemáticas están presentes en los distintos órganos de una planta y pueden diferenciarse para generar tejidos nuevos e incluso un individuo completo.

4. Cultivo Celular en Suspensión vs. Monocapa

Cultivo en suspensión: Las células crecen dispersas en el medio de cultivo sin necesidad de anclarse a un soporte sólido. Este método es común para células hematopoyéticas, células madre, líneas transformadas y tumorales, ya que no requieren adherencia para proliferar.

En los cultivos en monocapa, las células crecen adheridas sobre un soporte sólido formando una capa de células de espesor.

5. Utilidades del Cultivo en Suspensión de Células Vegetales

• Obtención de protoplastos.
• Disgregación celular a partir de callos formados a partir del cultivo de explantes.

6. Células Transformadas: Importancia en Cultivos Celulares

Las células transformadas son el resultado de un cambio genotípico denominado transformación. Sus características incluyen:

• Inmortalidad: Crecen indefinidamente.
• Crecimiento aberrante: No hay inhibición por contacto ni dependencia del anclaje.
• Malignidad: Invaden tejidos y forman tumores.
• Inestabilidad genética: Variación en el número de cromosomas.

7. Mecanismos Celulares en la Generación y Cultivo de Callos

El callo corresponde a un crecimiento celular, normalmente de la zona de la periferia del tejido en contacto con el medio de cultivo. Posteriormente, cultivando el callo en condiciones adecuadas, se puede inducir una rediferenciación celular a partir de la cual se desarrollan órganos de plantas o bien embriones somáticos.

8. Función del Oxígeno y CO2 en la Atmósfera de Incubación

Se necesita aporte de O₂ para oxidar. Se produce CO₂, que es muy importante para el mantenimiento del pH del cultivo a través del sistema tampón bicarbonato-CO₂. El CO₂ al disolverse en agua forma ácido carbónico, el cual puede disociarse para dar bicarbonato, liberando un protón.

9. Transformación de Especies Vegetales por Agrobacterium tumefaciens

Se cultivan conjuntamente las células de Agrobacterium y de la especie vegetal a transformar. Se aprovecha la capacidad del Agrobacterium para infectar las células, transfiriéndoles el gen de interés. Las células infectadas proliferarán hasta generar una nueva planta que será capaz de expresar el gen de interés con el que han sido transformadas.

10. ¿Qué son los Protoplastos?

Los protoplastos son células vegetales sin pared celular, desagregadas unas de otras. Para ello, se emplean disoluciones enzimáticas para la maceración de los tejidos de la planta original. Suelen ser mezclas con enzimas tales como pectinasas, celulasas y hemicelulasas. Los protoplastos ofrecen dos opciones en el campo de la ingeniería genética:

1. La posibilidad de ser transformados con ADN exógeno con relativa facilidad.
2. La fusión de protoplastos origina células vegetales con carga genética diferente a las células iniciales.

11. Verdadero o Falso

Corrección de las afirmaciones:

• a. La tripsina se inactiva: Falso
• b. Densidad: Verdadero
• c. Rojo fenol: Verdadero
• d. Concentración 10ppm: Falso
• e. El pH neutro: Falso
• f. Desarrollo de callos: Falso
• g. Fotosíntesis: Falso
• h. Gas líquido: Falso
• i. Línea celular: Falso
• j. La desadaptación: Falso

Biotecnología y Bioprocesos

1. Obtención de una Proteína Recombinante

La biotecnología permite obtener ADN recombinante cortando y ligando fragmentos de ADN vector o portador con un gen procedente de un ADN donante. Luego, dicho ADN recombinante se introduce en el interior de una bacteria aumentando su genoma o dotación genética, paso que se denomina transformación.

2. Ventajas de un Cultivo Semicontinuo

Se controla la reacción y se monitoriza el crecimiento agregando medio fresco cuando se alcanza una determinada concentración de biomasa. Esto permite mantener células en fase exponencial, reduciendo tiempos largos.

3. Desventajas de Cultivos Continuos y Semicontinuos

Sus desventajas incluyen riesgos de contaminación y mutaciones celulares por el uso prolongado de la misma cepa.

4. ¿Qué es un Homogeneizador?

Un homogeneizador es un método mecánico para la rotura celular. Los homogeneizadores emplean bombas de alta presión que fuerzan al cultivo de bioproceso a atravesar un orificio de dimensiones regulables aplicando presiones superiores a 500 atm. La rotura se produce en la válvula de cavitación.

5. Operaciones Básicas del Upstream y la Importancia del Downstream

Las operaciones básicas del upstream incluyen:

• Selección, diseño e ingeniería molecular de las especies o cepas, así como la modificación de los sistemas de expresión genética de la célula.
• Mejora de la especie o cepa, o modificación genética.
• Preparación de medios y de materias primas.
• El escalado del biorreactor.

Los procesos de downstream son decisivos para reducir los costos de los bioprocesos, ya que en la mayoría de los casos el costo del tratamiento de los productos representa entre el 60 y el 80% de los costos del proceso de producción. Por lo tanto, el éxito o el fracaso de un nuevo producto dependen mucho de la eficiencia que se logre en la etapa de downstream.

6. Especificidad de las Reacciones Enzimáticas

Las enzimas de restricción reconocen secuencias cortas concretas en la cadena doble hebra del ADN. Las enzimas de restricción cortan de una manera fija en cada caso la cadena de ADN. Son endonucleasas.

7. Disrupción Celular y Auxiliares de Filtrado

La disrupción celular resulta necesaria en los casos en que los productos de interés están en el interior de las células, empleando técnicas como homogeneización.

El auxiliar de filtrado puede utilizarse como una pre-cubierta del medio filtrante para prevenir el bloqueo del filtro por los sólidos, evitando que los sólidos se acumulen en los poros de la tela y la obstruyan.

8. Técnicas de Concentración en la Recuperación del Producto

Las tres técnicas de concentración más habituales en la recuperación del producto de interés tras el bioproceso son:

• Microfiltración: para partículas de 0,02 a 10 μm, recuperación de biomasa cercana al 100%.
• Ultrafiltración: para partículas de 3 a 100 nm.
• Diafiltración: misma instalación ultra, pero solo para lavar y dializar las sales con agua limpia.