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Aislamiento de ADN

La tecnología del ADN recombinante ha revolucionado el estudio de la célula, y la molécula de ADN ha pasado a ser muy simple de estudiar. Desde el año 1953, cuando Watson y Crick propusieron el modelo de la doble hélice como estructura del ADN, se han obtenido innumerables avances en el campo de la biología molecular y se han desarrollado muchas técnicas genéticas sofisticadas. La construcción de moléculas de ADN recombinantes y artificiales se denomina Ingeniería Genética, a causa de su potencial para crear nuevas combinaciones genéticas por medios bioquímicos. El proceso también se denomina clonación molecular o clonación genética, porque se pueden propagar en una estirpe de organismos genéticamente idénticos, los cuales todos contienen la molécula compuesta y, al crecer, la amplifican, así como cualquier producto génico cuya síntesis sea dirigida por ella.

Pasos para aislar el ADN:

1. Homogenización
2. Lisis celular
3. Disociación
4. Extracción/precipitación
5. Redisolución

1. Homogenización

Donde se intenta realizar un proceso que retrase la separación. Una mezcla uniforme de las sustancias con similares fases.

2. Lisis Celular

Es la rotura de la membrana celular.

2.1. Métodos Químicos

• Tratamiento con álcalis
• Tratamiento con lisozima + EDTA
• Empleo de detergentes

2.2. Métodos Físicos

• Sonicación
• Choque osmótico
• Congelación/descongelación
• Homogeneización con abrasivos
• Cizalla líquida
• Cizalla sólida

3. Disociación o Proteólisis

La proteólisis es la degradación de proteínas ya sea mediante enzimas específicas, llamadas proteasas, o por medio de digestión intramolecular, que catalizan la ruptura de solo una o de pocas uniones peptídicas.

Se utilizan enzimas proteolíticas como la pronasa, la cual es activa contra un amplio espectro de proteínas naturales. La pronasa se debe autodigerir a 37 °C por lo menos una hora antes de utilizarla. Una vez concluida la digestión con proteasa, se realiza una digestión de RNasa para eliminar la presencia de RNA.

4. Extracción

Se eliminan las proteínas de la muestra utilizando solventes orgánicos como el fenol. El fenol utilizado en la extracción de las proteínas debe ser bidestilado o ultrapuro, y se utiliza a una relación 1:1 volumen por volumen con la muestra que se pretende limpiar.

Generalmente se recomienda realizar 1 extracción con fenol seguida de 1 extracción de fenol:cloroformo (1:1), y por último una última extracción con cloroformo para limpiar toda traza de fenol.

5. Precipitación

Para poder concentrar el ADN después de la eliminación de las proteínas, se utiliza una serie de sales entre las que se encuentra el acetato de sodio, acetato de potasio, acetato de amonio y cloruro de litio entre las más usadas.

Una vez que el ADN ha estado en contacto con los cationes seleccionados se precipita con 2 volúmenes de etanol absoluto o 1 volumen de isopropanol bajo las siguientes condiciones: mayor a 2 h a 20 °C, de 15 a 30 min a -70 °C, o 10 o 15 min en hielo seco con etanol.

6. Redisolución

Si se suspende en un tapón que puede ser de Tris-EDTA. El EDTA ayuda al agotamiento de iones que se utiliza comúnmente para inactivar enzimas dependientes de metal que podrían dañar el ADN o las proteínas.

Aislamiento del ADN Bacteriano

El ADN en las bacterias se encuentra libremente en el citoplasma celular en contacto con otras biomoléculas, debido a que no cuenta con un núcleo definido. Se toman tres puntos básicos para aislar ADN bacteriano.

1. Se procede a romper las células.
2. Inhibir las enzimas (nucleasas o proteasas) que se liberen durante la disrupción celular.
3. Emplear un método que permita un alto rendimiento y pureza del producto.

Se rompe la pared celular que es una envoltura fuerte y rígida que da forma a las células bacterianas. Está formada por una capa de mureína, que es un peptidoglucano formado por una red cuya base es N-acetilglucosamina (NAG) y N-acetilmurámico (NAM). En función de las modificaciones de esta mureína y mediante la tinción de Gram se pueden diferenciar dos tipos de bacterias: Gram positivas y Gram negativas.

Presenta importantes funciones, como mantener la forma de la bacteria frente a las variaciones de presión osmótica y actuar como membrana semipermeable, regulando el paso de iones. La destrucción de la pared deja inerme a la bacteria.

Etapas del Aislamiento de ADN Bacteriano

1. Inicialmente se rompe la célula con la enzima lisozima, la cual hidroliza el peptidoglicano de las paredes celulares facilitando el shock osmótico.
2. Lisis celular por disrupción de las membranas celulares por el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS). Este también reduce la actividad de las nucleasas por su capacidad de desnaturalizar proteínas.
3. La adición de agentes quelantes como el ácido etilen diamino tetra acético (EDTA) también inhibe las nucleasas removiendo los cationes divalentes.
4. Purificación del DNA mediante la mezcla cloroformo-alcohol isoamílico. Se usa para desnaturalizar y precipitar proteínas.
5. El DNA libre de proteínas se aísla mediante precipitación con etanol.

Materiales

• Cultivo bacteriano
• Tubos Falcon
• Incubadora con agitación a 37 °C
• Solución NaCl 0.15 M – 0,1 M EDTA
• Centrífuga
• Solución salina estéril
• Solución de lisozima (10 mg/ml)
• SDS 25% (P/V)
• Cloroformo-alcohol isoamílico
• Etanol 95%
• Isopropanol
• Cloroformo
• Tubos Falcon de 15 ml
• Vasos de precipitación de 50 ml
• Pipeta
• Cultivo bacteriano de 24 horas en medio Luria Bertani, LB (composición en g/l: Peptona, 10; extracto de levadura, 5; NaCl, 5; pH 7).

• Incubadora con agitación a 37 °C

• Centrífuga

• Isopropanol

• Tubos Falcon de 15 ml

• Vasos de precipitación de 50 ml

• Pipeta

Procedimiento

1. Inocular 100 ml de medio LB con una alícuota de cepa bacteriana (Escherichia coli JM 109). Incubar en agitación por 24 horas a 37 °C.
2. Verter el cultivo en tubos Falcon de 15 ml y centrifugar a 6000 rpm durante 10 minutos.
3. Lavar las células con solución salina fisiológica estéril (NaCl 0.85%): resuspender con 5 ml de solución salina y centrifugar a 6000 rpm durante 10 minutos, eliminar sobrenadante.
4. Resuspender las células en 2,5 ml de solución NaCl 0,85%-EDTA 0,1 M y añadir 0,1 ml de solución lisozima (10 mg/ml). Incubar la suspensión a 37 °C por 30 minutos en agitación.
5. Completar la lisis por adición de 0,2 ml de SDS al 25% (P/V) y calentar esta preparación por 10 minutos a 60 °C en baño maría.
6. Añadir 3.5 ml de solución de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y mezclar suavemente.
7. Transferir la mezcla a un tubo Falcon de 15 ml y centrifugar a 6000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente.
8. Separar la fase acuosa (superior) cuidadosamente con una pipeta evitando contaminar con la fase inferior y traspasarla a un frasco de 10 ml.
9. Agitar suavemente la solución de ácidos nucleicos con una bagueta mientras se añade lenta y suavemente dos volúmenes de etanol al 95%. Evitar la agitación vigorosa que puede destruir el ADN.
10. El DNA forma una película fibrosa en la interfase agua-etanol. Se continúa agitando suavemente hasta que se mezclen las fases y todo el DNA haya quedado en la bagueta.
11. Secar el exceso de líquido presionando la bagueta en las paredes del vaso de precipitación.
12. Lavar la muestra por inmersión del ADN adherido a la bagueta en un tubo de ensayo conteniendo etanol al 70% (1 ml) y luego al 95% (1 ml).
13. Dejar secar a temperatura ambiente.
14. Recuperar el DNA en un tubo de ensayo con agua destilada libre de nucleasas o buffer TE (Tris-EDTA), mediante agitación de la bagueta en sentido reverso.

Conclusión

• Es un mecanismo mediante el cual, a base de determinados procesos, vamos a romper las células hasta lograr tener el ADN bacteriano con el mayor grado de pureza posible.
• La bacteria crece en un medio de cultivo líquido: una fuente de fósforo, azufre y nitrógeno.
• Para poder realizar este experimento debemos esperar la multiplicación de las bacterias; es decir, debemos trabajar con las colonias.
• Las nucleasas son las enzimas que debemos de inhibir con mayor importancia debido a que ellas cortan el ADN.
• El SDS, por ser un detergente, no debe ser utilizado antes que la lisozima, ya que esta última, por ser una enzima, sería degradada por el detergente y no llegaría a cumplir su función en la pared celular.
• Cuando se realiza la limpieza del ADN, esta se debe hacer con una agitación suave, ya que este se puede romper.
• El ADN, después de todos los procesos antes dichos, se queda pegado en la punta de la pipeta como goma.

Biología Molecular del Cáncer

Las células normales crecen, se dividen y mueren de manera ordenada. Los mecanismos de control de crecimiento y división celular son muy variados, pero están regulados por la expresión de los genes que se encuentran en el núcleo celular, los cuales trabajan de manera coordinada.

El cáncer se desarrolla cuando la célula hace caso omiso a los mecanismos de control de crecimiento, proliferación y muerte; como resultado, comienza a dividirse y proliferar de manera anormal. Esta única célula genera miles de millones de células, igualmente alteradas, que constituyen un tumor maligno.

El cáncer se debe a una proliferación descontrolada de una sola célula extraña, se dice que es monoclonal.

Diferentes Tipos de Cáncer

El cáncer puede originarse casi en cualquier parte del cuerpo.

1. Los carcinomas, los tipos más comunes de cáncer, se originan de las células que cubren las superficies externas e internas del cuerpo. Los cánceres de pulmón, de seno (mama) y de colon son los cánceres más frecuentes.
2. Los sarcomas son cánceres que se originan de células que se encuentran en los tejidos de soporte del cuerpo, como por ejemplo, hueso, cartílago, grasa, tejido conectivo y músculo.
3. Los linfomas son cánceres que se originan en los ganglios linfáticos y en los tejidos del sistema inmunológico del cuerpo.
4. Las leucemias son cánceres de las células inmaduras de la sangre que crecen en la médula ósea y que tienen la tendencia a acumularse en grandes cantidades en el torrente sanguíneo.

Morfología y Crecimiento Tumoral

Las células tumorales tienen una morfología alterada que depende de la diferenciación y de la anaplasia. La diferenciación celular de un tumor es el grado en el que las células cancerosas se asemejan a las células no cancerosas de las que proceden, tanto morfológica como funcionalmente. Las células sanas que constituyen el organismo están muy diferenciadas, lo que les permite realizar funciones específicas. Generalmente, los tumores benignos son bien diferenciados y los tipos de cáncer varían desde los muy diferenciados hasta los indiferenciados. Un grado de diferenciación bajo indica que las células tumorales son muy diferentes a lo que deberían ser para desarrollar las funciones habituales en el organismo. La anaplasia es la ausencia de diferenciación que conlleva a una falta de especialización o de función celular. Cuanto más indiferenciado sea un cáncer, mayor es su malignidad y más alta es su velocidad de crecimiento.

El crecimiento del cáncer es descontrolado y acelerado por un proceso de división celular continuo. Además, las células tumorales son capaces de infiltrar o penetrar en los tejidos normales e invadirlos, destruyendo las células normales del órgano afectado, que pierde su función. También viajan a través de los vasos sanguíneos o linfáticos a otras partes del organismo, produciendo tumores hijos o metástasis. Las principales características de los tumores malignos son las siguientes:

• Angiogénesis: es la capacidad de formar nuevos vasos sanguíneos por medio de la secreción de ciertas sustancias, como el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), responsables de la formación de extensas redes de capilares y vasos sanguíneos nuevos. Los nuevos vasos son indispensables para la nutrición de las células tumorales y de las metástasis y le permite al parénquima tumoral tener un gran aporte de oxígeno y nutrientes, lo cual favorecerá su crecimiento y proliferación a mayor velocidad y distancia. Esta capacidad se encuentra generalmente ausente en neoplasias benignas.
• Pérdida de adherencia celular: las células tumorales, para poder diseminarse, deben ser capaces de romper su unión con la estructura del tejido en el que se originan. En el cáncer, la adhesión entre células se reduce por la pérdida de las moléculas de adhesión celular (MAC), las cuales son proteínas localizadas en la superficie de la membrana celular, que están implicadas en la unión con otras células o con la matriz extracelular.
• Proteólisis: las células tumorales producen enzimas proteolíticas (proteasas) que degradan la matriz extracelular y favorecen la expansión y diseminación del tumor.
• Movilidad: es la migración de las células malignas, algunas de las cuales abandonan el tumor primario, viajan a un sitio alejado del organismo por medio del sistema circulatorio o linfático y se establecen como un tumor secundario de las mismas características que el primitivo (metástasis).
• Metástasis: en general, lo que diferencia un tumor maligno de otro benigno es la capacidad que poseen sus células de lograr una trasvasación exitosa (o metastatizar), que se define como la capacidad que posee una célula tumoral de infiltrarse al torrente sanguíneo o linfático, mediante la ruptura de moléculas de adhesión celular que sujetan a las células a la membrana basal, con posterior destrucción de esta última. Esta característica se adquiere luego de sucesivas alteraciones en el material genético celular. Los órganos en los que se producen metástasis con más frecuencia son huesos, pulmones, hígado y cerebro. No obstante, distintos tipos de cáncer tienen preferencias individuales para propagarse a determinados órganos.

Genética del Cáncer

El cáncer es una enfermedad genética producida por la mutación en determinados genes que pueden ser:

• Los protooncogenes son genes normales, y los oncogenes, sus versiones defectuosas.

  Los protooncogenes son genes normales que codifican proteínas comprometidas con el control de la proliferación celular. Hasta el momento se han caracterizado aproximadamente 100.

• Los oncogenes se diferencian de los protooncogenes debido a que se transcriben desmesuradamente (lo que da lugar a cantidades excesivas de sus productos) o generan productos aberrantes. En ambos casos, la consecuencia es un aumento descontrolado de la proliferación celular.

Un solo alelo alterado en un protooncogén es suficiente para cambiar el fenotipo de una célula normal por uno de una célula cancerosa.

• Genes supresores tumorales: son los encargados de detener la división celular y de provocar la apoptosis. Cuando se mutan estos genes, la célula se divide sin control. Suelen ser factores de control transcripcional y traduccional. Cuando pierden su función normal (por deleción, translocación, mutación puntual) se originan tumores.
• Genes de reparación del ADN: cuando el sistema de reparación es defectuoso como resultado de una mutación adquirida o heredada, la tasa de acumulación de mutaciones en el genoma se eleva a medida que se producen divisiones celulares. Según el grado en que estas mutaciones afecten a oncogenes y genes supresores tumorales, aumentará la probabilidad de padecer neoplasias malignas.