Aislamiento e Identificación de Bacilos Gram Positivos: Género Corynebacterium
Introducción
El género Corynebacterium comprende un grupo heterogéneo de bacterias, incluyendo especies comensales y patógenas para animales, plantas y bacterias del suelo.
Características comunes del género:
- Bacilos pleomórficos Gram positivos, no forman esporas.
- Las células se dividen abruptamente (efecto de resorte), resultando en una disposición en «letras chinas».
- Aerobios o anaerobios facultativos.
- Catalasa positivos.
- Citocromo oxidasa negativo.
La especie tipo es Corynebacterium diphtheriae, causante de la difteria, una infección aguda, contagiosa y febril. Se caracteriza por la inflamación local y formación de una seudomembrana en la orofaringe, además del daño al corazón y nervios periféricos por acción de una exotoxina (toxina diftérica). Se propaga por portadores sanos y convalecientes, siendo su puerta de entrada las vías respiratorias superiores.
El género se divide en tres grupos:
- Grupo I: Corinebacterias parásitas y patógenas para el hombre y animales.
- Grupo II: Corinebacterias fitopatógenas.
- Grupo III: Corinebacterias no patógenas.
Algunas de las especies más frecuentes en el laboratorio clínico son: C. diphtheriae, C. pyogenes, C. ulcerus, C. haemolyticus, C. xerosis, C. renale, C. equi, C. ovis, C. bovis y C. hoffmannii (pseudodiphthericum).
La muestra debe ser tomada con un hisopo, frotando enérgicamente sobre cualquier lesión inflamatoria. Además del hisopado de garganta, se requieren muestras de nasofaringe, y deben enviarse inmediatamente al laboratorio o inocularse directamente en medio suero de Loeffler o Agar telurito.
Material
- Cepa de Corynebacterium diphtheriae en caldo enriquecido.
- Placa con Agar sangre.
- Placa con Agar chocolate telurito de potasio.
- Tubo de 13×100 con medio Pai en plano inclinado.
- Set de colorantes de Gram.
- Set de colorantes de Albert.
- Tubos con Agar Urea Christensen en plano inclinado.
- Caldo Rojo de fenol + Glucosa.
- Caldo Rojo de fenol + Maltosa.
- Asas de siembra.
- Láminas portaobjetos.
- Aceite de inmersión.
- Microscopio.
Procedimiento
- Tomar el inóculo de la cepa de C. diphtheriae y realizar la siembra por el método de dispersión-agotamiento en las placas de Agar sangre y Agar chocolate, y en el medio Pai por estrías. Incubar por 48 horas a 37°C.
- Realizar el frotis del cultivo en caldo enriquecido y colorear por Gram.
- Realizar el frotis del cultivo y colorear por el método de Albert.
- Bioquímica: Sembrar en los medios diferenciales de Agar Urea de Christensen, caldo Rojo de fenol + Glucosa, y caldo Rojo de fenol + Maltosa.
Coloración de Albert
Los gránulos metacromáticos, también conocidos como de volutina, son material de reserva de polifosfato. Se distribuyen en el citoplasma, preferentemente en los extremos del bacilo. Se tiñen de color azul intenso, mientras que el soma bacteriano se observa débilmente.
Procedimiento de la Coloración de Albert
- Realizar el frotis a partir del cultivo y fijar al calor suave.
- Cubrir con la Solución A de Albert (Azul de toluidina, verde de metilo, ácido acético, alcohol etílico, agua destilada) por 3 a 5 minutos.
- Lavar con agua corriente, evitando el lavado directo del frotis.
- Cubrir con la Solución B de Albert (yodo metálico, yoduro de potasio, agua destilada) por 1 minuto.
- Lavar con agua corriente, secar y observar al microscopio, con objetivo de 100X.
Lectura e Interpretación
- Coloración Gram-Kopeloff: Observar los bacilos rectos o ligeramente curvados, ensanchados en sus extremos como mazos, pleomórficos (en forma de pera, huso) o dispuestos paralelamente, o en forma de «letras chinas».
- Coloración Albert: Observar la bacteria color verde y los gránulos de color azul oscuro.
- Cultivo en Agar chocolate telurito de potasio (medio selectivo inhibidor de Gram negativos): Observar los tres tipos de bacilos diftéricos:
- Tipo gravis: Colonias grandes grisáceas.
- Tipo mitis: Colonias medianas, circulares, lisas, totalmente negras.
- Tipo intermedius: Colonias pequeñas, lisas o rugosas, con centro negro.
- Cultivo en Agar sangre: Observar el crecimiento de colonias pequeñas, convexas, con bordes enteros, color crema o blanco grisáceas. Solo las colonias Tipo mitis producen beta hemólisis.
Protocolo de Trabajo
Realizar esquemas de lo realizado y observado en la práctica.
Grupo III (Microorganismos no cromógenos): No pigmentan espontáneamente, ni por estímulo luminoso. Ejemplo: M. tuberculosis var. Humano y M. tuberculosis var. Bovina
Grupo IV (Crecimiento rápido): Pueden pigmentar o no. Crecen en 7 días o menos. Ejemplo: M. fortuitum