Espectrofotometría

Espectrofotometría: Medida de la atenuación que el material a estudiar efectúa sobre una radiación incidente sobre el mismo con un espectro definido (entre 220 y 800 nm).

• Radiación visible (+380 nm)
• Radiación ultravioleta (-380 nm)

Cromóforo: Estructura de enlaces conjugados que permite la absorción de luz.

Leyes de la Espectrofotometría

Relaciones existentes entre la cantidad de absorbente y el grado con el que es absorbida la energía radiante. Hay dos variables capaces de afectar el grado de absorción:

• Concentración del absorbente
• Longitud del trayecto que el rayo luminoso recorre a través de la solución.

Ley de Lambert-Beer

Establece que la absorción es proporcional al número de moléculas de la sustancia absorbente presente en la solución por donde pasa el haz electromagnético. A = εlc.

La absorbancia es directamente proporcional a la concentración.

Espectrofotómetro

Fuente de luz: Emite luz a las longitudes de onda que se quiere medir.

Selector de longitud de onda: Permite el paso de luz a la longitud de onda deseada.

Orificio: Define la intensidad de luz incidente sobre la muestra dispuesta en una cubeta (diámetro 1 cm) que no interfiere con el paso de la luz.

Detector: Cuantifica la luz emitida, dando la lectura directa de la absorbancia o bien, % de transmitancia. A = 2 – log%T.

La relación entre la concentración y la absorbancia es lineal, cosa que no sucede con el %T.

Muestra blanco: Descarta la absorbancia de las interferencias.

Curva de calibración: Relaciona las A o %T con las concentraciones y se ocupa para calcular la concentración del absorbente.

Proteínas

Biomoléculas formadas por una secuencia de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos (enlace amida).

Niveles de Organización

• Conformación 1: Orden o secuencia de unión de los aminoácidos.
• Conformación 2: Primer grado de plegamiento de la cadena polipeptídica.
• Conformación 3: Forma tridimensional en el espacio y una superficie exterior característica.

Desnaturalización: Pérdida parcial o total de su configuración terciaria. Tienen menor solubilidad y originan precipitado.

Cuantificación de Proteínas

• Biuret: Presencia de 2 o más enlaces peptídicos, color púrpura. Desventaja: su sensibilidad, alrededor de 1 mg.
• Bradford: Cambio de la longitud de onda máxima de 465 nm a 595 nm. Color azulado en 2 minutos por 1 hora. Sensibilidad: 10 a 20 µg de proteína por ml.

Equilibrio Químico y Cinética Enzimática

Equilibrio químico: Tanto la reacción directa como la inversa están ocurriendo en el mismo grado.

Catalizador: Aumenta la velocidad a la que la reacción se acerca al equilibrio, pero no altera la naturaleza del estado de equilibrio.

Cinética enzimática: Indica que una solución está hecha de un grupo de moléculas y cada una se mueve a una velocidad particular y chocan entre sí, y estos choques involucran cierta cantidad de energía.

Energía de activación: Es la energía mínima que se requiere para la formación de este intermediario.

Cambio de energía libre (ΔG): Diferencia de energía libre que se produce entre el estado inicial y el producto final.

Actividad enzimática: Se determina midiendo la cantidad de producto formado o sustrato consumido por unidad de tiempo.

Análisis de la curva de progreso: Mide toda la curva de la reacción y ajusta estos datos a una ecuación no lineal.

Factores que Modifican la Actividad Enzimática

• Concentración de enzima: La actividad enzimática es directamente proporcional a la concentración de la enzima a factores ambientales constantes (temperatura y pH).
• Concentración de sustrato:
  • Michaelis-Menten: Describe la relación entre la velocidad y la concentración de sustrato.
  • Km: Indica el grado de afinidad de la enzima por un sustrato; es inversamente proporcional a la fuerza de unión entre la enzima y el sustrato.
• Temperatura: El aumento de temperatura causa un aumento en la velocidad de reacción, por lo que hay más colisiones efectivas entre las moléculas, debido al aumento de la energía cinética de las moléculas participantes en la reacción.
• pH: Valores mayores o menores al rango de pH óptimo provocan una disminución de la actividad.

Métodos de Análisis

• Blanco sustrato: Para medir la actividad enzimática, se reemplaza la solución que contiene al sustrato por un volumen equivalente de su solvente (volumen reemplazado por agua o el buffer de la reacción).
• Blanco enzima: Para medir la actividad enzimática, se reemplaza la solución que contiene a la enzima por un volumen equivalente de su solvente.
• Tiempo cero: Para medir la actividad enzimática, consiste en detener la reacción en el momento mismo en que se inicia (tiempo cero). Por lo general, una reacción enzimática se inicia con la adición de la enzima o bien con la de su sustrato. El producto formado se determina con un espectrofotómetro.

Glucosa y Glucógeno

Glucosa: Monosacárido del tipo polihidroxialdehído de baja masa molecular; químicamente corresponde a una aldohexosa. Está formada por 6 átomos de carbono y un grupo aldehído en el C1. En solución acuosa, forma un ciclo de 5 miembros (piranosa).

Disacáridos: 2 unidades.

Oligosacáridos: Cadenas cortas.

Polisacáridos: Más de 10 unidades.

Enlaces glicosídicos: Tipo éter.

Funciones de los Carbohidratos

• Forman parte de los tejidos de sostén en plantas y animales (celulosa, almidón, algodón, ADN).
• Fuente importante de energía.

Glucógeno

Energía: (Glucógeno) 12 a 18 unidades de D-glucosa unidas por enlaces α(1,4) y α(1,6).

• Hígado: El glucógeno tiene como misión mantener el nivel de glucosa en la sangre (glicemia) constante.
• Músculos: El glucógeno se utiliza para abastecer de energía (ATP) al proceso de contracción muscular.

Glucogenólisis

Obtención de moléculas de glucosa libre en el momento que se necesiten por 3 procesos:

1. Glucógeno fosforilasa: Cataliza la denominada escisión fosforilítica de los enlaces glicosídicos α(1,4), que consiste en la separación secuencial de restos de glucosa desde el extremo no reductor.
2. Enzima desramificante del glucógeno: Degrada los enlaces α(1,6).
3. Fosfoglucomutasa: Transforma la glucosa-1-P en glucosa-6-P (es reversible).

Enzimas claves: Glucógeno fosforilasa y glucógeno sintetasa, actúan dependiendo de glucagón e insulina.

• Hipoglucemia: Nivel de glucosa en la sangre bajo. El glucagón activa la acción de la glucógeno fosforilasa, estimulando la degradación del glucógeno en el hígado, liberando glucosa al torrente sanguíneo.
• Hiperglucemia: Nivel de glucosa en sangre alto. La insulina activa la acción de la glucógeno sintetasa, que estimula la síntesis de glucógeno; la concentración de glucosa libre en la sangre disminuye.

Colesterol

Las grasas son compuestos con los que el cuerpo almacena energía para las épocas de carencia.

• Simples: Colesterol y ácidos grasos.
• Complejos: Fosfolípidos, triglicéridos.

Colesterol: Grasa presente en todas las células animales, altas concentraciones en médula espinal, páncreas y cerebro, y es sintetizada en el hígado y el intestino delgado.

Estructura: Una cabeza polar constituida por el grupo hidroxilo y una cola o porción apolar formada por los distintos ciclos y los sustituyentes alifáticos. Por lo que es una molécula hidrofóbica, soluble en disolventes apolares como cloroformo, acetona y éter.

Vía exógena: Absorción del colesterol contenido en los alimentos (exclusivamente en alimentos de origen animal).

Vía endógena: Síntesis de colesterol en las células animales a partir de su precursor, el acetato, en su forma activada acetil-CoA.

Regulación: Una alta ingesta de colesterol en alimentos lleva a una disminución neta de la producción endógena y viceversa.

Funciones del Colesterol

• Estructural: Componente importante de las membranas plasmáticas de los animales.
• Precursor de vitamina D: Esencial en el metabolismo de calcio.
• Precursor de hormonas sexuales: Progesterona, estrógenos, testosterona.
• Precursor de sales biliares: Absorción de algunos nutrientes lipídicos y vía principal para la excreción de colesterol corporal.

Transporte: Utiliza moléculas complejas llamadas lipoproteínas, formadas por una parte proteica y una parte lipídica, compuesta de distintos tipos de grasas.

• LDL: Compuesta por colesterol y por la proteína apoB. Es la forma en que el organismo recoge el colesterol del hígado y lo distribuye a los tejidos. El LDL colesterol (70% del circulante en sangre) es el colesterol «malo», responsable de la aterosclerosis o acumulación del colesterol en la pared de las arterias (infarto al miocardio).
• HDL: Compuesto por colesterol y la proteína apoA. Estas partículas contienen el denominado colesterol «bueno», porque transportan el exceso de colesterol desde los tejidos hasta el hígado.

Colesterolemia: 150 a 200 mg/100 ml.

• < 200 mg/dl: Concentración deseable para la población general, ya que se relaciona con bajo riesgo de enfermedad cardiovascular.
• 200-239 mg/dl: Riesgo intermedio en la población general, pero es elevado en personas con otros factores de riesgo, como diabetes.
• > 240 mg/dl: Alto riesgo cardiovascular, y se recomienda un cambio en el estilo de vida, sobre todo en relación a la dieta y al ejercicio físico.

Aterosclerosis: Consiste en el depósito de células cargadas de partículas de LDL colesterol en las paredes de las arterias. Crea una placa que, con el paso del tiempo, aumenta de tamaño hasta que estrecha la arteria, dificultando la circulación de la sangre, lo que puede producir una angina de pecho o infarto al miocardio por falta de oxígeno y nutrientes.