EXAMEN PRÁCTICO BIOLOGÍA – RESPUESTA PROPUESTA
El ratón
NOD es un modelo utilizado para el estudio de la diabetes tipo 1. Acabo de demostrar que utilizando un tipo de células madre derivadas de médula ósea has sido capaz de revertir la patología. Para ello he usado células derivadas de un ratón que expresa la proteína verde fluorescente GFP. ¿Cómo podrías averiguar el mecanismo de acción de estas células utilizando las tres estrategias presentadas EN CADA UNA de las prácticas de la asignatura (Inmunohistoquímica, citometría de flujo y proteómica)
? Describe las herramientas que utilizarías para demostrar que el tratamiento ha sido efectivo en comparación con otro ratón NOD que no ha recibido el tratamiento.
- Citometría de flujo:
Para evidenciar el éxito del tratamiento con esta estrategia, partiremos de las dos muestras del apartado anterior. En ambas preparaciones introduciremos un anticuerpo asociado a un fluorocromo que sea específico de la insulina de ratón y cuya longitud de onda de fluorescencia sea diferente a la de la GFP. Dado que el valor que queremos estudiar (presencia de insulina) es intracelular, deberemos permeabilizar la membrana previamente y fijarla con formaldehído para que el anticuerpo pueda entrar correctamente. Ajustaremos la longitud de onda del citómetro de flujo para que se ajuste al del fluorocromo escogido y pasaremos las células de ambas preparaciones por el aparato mediante el flujo laminar aspirado a través del cañón de luz para estudiar la fijación de los anticuerpos. En el caso de las primeras muestras, en el histograma observaremos una señal positiva (entre 10^4 y 10^5 unidades) de anticuerpos unidos a insulina mientras que en las células del ratón NOD no tratado, la señal será negativa, demostrando así que, en el caso del ratón tratado, las células madre derivadas producen insulina y, por lo tanto, sirven para tratar la diabetes tipo 1.
- Proteómica:
Para la proteómica, usaremos un marcador biológico para determinar si las células trasplantadas son funcionales (es decir, producen insulina). Para ello obtendremos una muestra de orina o sangre de ambos ratones (el que ha recibido el tratamiento y el diabético normal) y mediante espectrometría de masas que nos permita separar las proteínas presentes en las muestras. Después, compararemos ambas muestras con los valores de normalidad de un ratón no diabético, información que obtendremos de las bases de datos bioinformáticas. Si el proteoma del ratón NOD tratado es similar al de un ratón normal (sobre todo nos fijaremos en las proteínas relacionadas con el control de la glucemia, información que sacaremos de programas informáticos como String) mientras que el del ratón enfermo no tratado presenta una disminución, por ejemplo, en los valores de insulina, es entonces cuando demostraremos la funcionalidad del trasplante celular.
Sin embargo, no solo nos fijaremos en la proteómica, sino también en la genómica, transcriptómica y metabolómica. Gracias a ello, por ejemplo podremos analizar los diferentes genes que se expresen para la síntesis de insulina, observando que en las células trasplantadas se expresa la síntesis de insulina y que, por lo tanto, son funcionales.
- Inmunohistoquímica
El primer paso sería obtener islotes beta de ambos ratones en cultivo. Un cultivo a (células del ratón NOD tratado) y otro b (células del ratón no tratado). Para proceder a la experiencia, primero rociamos las muestras con agua oxigenada para eliminar cualquier peroxidasa (la enzima que utilizaremos para el marcaje) que ya esté presente en el tejido a estudiar. Posteriormente añadiríamos una primera tanda de anticuerpos monoclonales específicos anti-insulina a ambos cultivos (se unirán a las moléculas de insulina). Los fijaríamos y posteriormente añadiríamos la tanda de anticuerpos secundarios anti-anti-insulina asociados a peroxidasas exógenas. Estos reconocerían los anticuerpos primarios y se unirían a ellos, quedando anclados a la insulina de las células madre derivadas. Todo lo anterior únicamente sucedería en el primer cultivo, ya que es el único que mantiene las células madre del tratamiento. Posteriormente añadiríamos la mezcla de revelado (un donante de electrones como el DAB diluido en agua oxigenada). Al hacer esto, en las células que tienen unidos los anticuerpos secundarios asociados a peroxidasas, estas reducirán el agua oxigenada, oxidando a su vez el DAB, que formará un complejo que precipitará de un color marrón visible al microscopio una vez hayamos lavado las preparaciones con agua y contrastado con hematoxilina, además de deshidratado con alcoholes y aclarado con xilol y cubierto con parafina. Estas “colonias” de elementos marrones serán únicamente visibles en la primera preparación (la única que presenta el tratamiento, ya que este consiste en la implantación de células exógenas que producen insulina) y el la segunda preparación, los anticuerpos con la peroxidasa no se habrán fijado en ningún lugar y, por lo tanto, no llevarán a cabo esta reacción de revelación. Queda demostrado que, en las células del ratón NOD tratado, se ha producido insulina (que produce la correcta absorción de glucosa desde el torrente hasta las células) y por lo tanto, estas servirán para tratar la diabetes tipo 1.