Ciclos de la PCR: Fases y Mecanismos

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se lleva a cabo en una serie de ciclos, cada uno de los cuales incluye tres fases o pasos:

1. Desnaturalización

Para que comience la reacción, es necesario que el ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue aplicando temperaturas de 90 a 95°C (ver figura 1), que producen la ruptura de los puentes de hidrógeno intercatenarios y, por lo tanto, la separación de ambas cadenas. Para conseguir la completa separación de las hebras de toda la muestra, esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente, este tenderá a renaturalizarse rápidamente, evitando así una eficiente hibridación de los iniciadores y una posterior extensión.

Figura 1. Desnaturalización de las hebras de ADN

2. Hibridación

Esta fase se denomina también fase de “annealing”, de asociación o de emparejamiento. Una vez que el ADN está desnaturalizado, se disminuye la temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 a 60°C para que se pueda producir la unión de los iniciadores a las secuencias flanqueantes del fragmento que se va a amplificar. La temperatura óptima de asociación depende de varios factores y es relativamente específica para cada iniciador. La longitud de los iniciadores y la secuencia son críticas en la designación de los parámetros de una amplificación. Una fórmula simple para calcular la temperatura de asociación (Ta) es la siguiente:

Ta = 4(G+C) + 2(A+T)

Donde G, C, T y A son la cantidad de nucleótidos presentes en la secuencia del iniciador.

Figura 2. Unión de los partidores a la hebra molde

3. Extensión

Durante este paso, la Taq polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo 3’ de los iniciadores, utilizando como molde las cadenas de ADN previamente desnaturalizadas. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser 72 +/- 5°C, ya que es a este rango de temperatura en el que la Taq-ADN polimerasa alcanza su máxima actividad.

Enzimas de Restricción: Características y Condiciones de Uso

Las enzimas de restricción, o endonucleasas de restricción, son enzimas que reconocen secuencias de ADN específicas y cortas, comúnmente palindrómicas (es decir, que la secuencia de nucleótidos en las dos cadenas complementarias en un segmento de ADN es la misma si se lee en la dirección 5’ a 3’ o 3’ a 5’). Estas enzimas cortan el ADN de doble hebra en sitios específicos dentro o contiguos a las secuencias de reconocimiento.

Figura 1. Secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción Pvu II.

La especificidad de cada una de las enzimas de restricción puede ser considerada como la característica más interesante. Aun cuando todas las enzimas de restricción se pueden unir a secuencias no específicas, bajo las condiciones adecuadas, la diferencia de la velocidad de corte del sitio afín es muy alta con respecto al siguiente mejor sitio. Sin embargo, en condiciones no óptimas, las velocidades de corte entre los sitios cambian fuertemente para muchas enzimas. Esta pérdida de fidelidad o el incremento de cortes en sitios similares al sitio afín se conoce como actividad star (estrella).

Cada enzima de restricción tiene requerimientos específicos para alcanzar su actividad óptima. Las condiciones ideales de almacenamiento y de reacción favorecen la mejor actividad y la mayor fidelidad en las funciones particulares de cada enzima. Las condiciones como la temperatura, el pH, la utilización de cofactores, la composición del buffer y la fuerza iónica afectan a la actividad y estabilidad enzimática.

Condiciones para una Reacción de Digestión Óptima

• pH: La mayoría de las enzimas de restricción se utilizan a pH de entre 7.2 y 8.5 (a temperatura de reacción). Un pH fuera de rango puede provocar actividad star.
• Mg²⁺: Las enzimas de restricción comerciales solo requieren Mg²⁺ como cofactor. Las enzimas de restricción son relativamente insensibles a la concentración de Mg²⁺. Sin embargo, la presencia de otros iones metálicos, especialmente el Mn²⁺, puede provocar actividad star.
• Suero Albúmina Bovina (BSA): Se utiliza en los amortiguadores de almacenamiento y se puede adicionar a la reacción de digestión para estabilizar la enzima. La BSA protege a las enzimas de restricción de las proteasas y de los factores ambientales como el calor, la tensión superficial y las sustancias que puedan interferir. La adición de 0.1 mg/mL de BSA puede aumentar de 1.5 a 6 veces la actividad enzimática.
• Glicerol: Se adiciona al amortiguador de almacenamiento para evitar la congelación de la enzima a -20°C. El congelar y descongelar repetidamente las enzimas de restricción puede reducir su actividad. La concentración de glicerol no debe ser mayor del 5% al momento de hacer la reacción de digestión.
• Temperatura de incubación: La mayoría de las enzimas de restricción muestran actividad máxima a 37°C. Son pocas las enzimas que requieren temperaturas menores o mayores. Generalmente, la temperatura de incubación de la enzima refleja la temperatura de crecimiento del microorganismo del cual se obtuvo.
• Volumen: Las soluciones viscosas de ADN inhiben la difusión de la enzima y pueden reducir la actividad enzimática. Las soluciones de ADN muy diluidas se pueden encontrar por debajo del Km de la enzima y se afecta su actividad. Para determinar el volumen, se debe considerar la fuerza iónica y la concentración final de glicerol. Los volúmenes de reacción recomendados son de 10 a 50 µL por µg de ADN.

Sustratos Comunes para la Digestión con Enzimas de Restricción

• ADN del bacteriófago lambda (λ): ADN lineal que es utilizado como un estándar para medir y expresar las unidades de actividad de las enzimas de restricción. En general, una unidad (1 U) es suficiente para cortar 1 µg de ADN de λ en 1 hora en 50 µL de volumen de reacción, bajo condiciones de reacción óptimas.
• ADN plasmídico: Comparado con el ADN lineal, la digestión completa del ADN plasmídico requiere más unidades de enzima debido a su superenrollamiento o al número de sitios por digerir (dependiendo del tamaño y secuencia del plásmido).
• ADN genómico: La digestión se dificulta debido a la metilación y la viscosidad. El ADN genómico se digiere con mayor eficiencia en concentraciones mínimas de 1 µg por 50 a 200 µL. Para mejorar la actividad enzimática, se puede calentar la muestra a 65°C o agregar BSA a la reacción.
• Productos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): El ADN amplificado por PCR puede ser digerido con enzimas de restricción que tienen sitios de reconocimiento dentro de la secuencia amplificada o en la región de los primers. La cantidad de unidades enzimáticas necesarias debe ser balanceada con el número total de sitios para asegurar la digestión completa.

Pureza de las Muestras de ADN

Además de la forma y la fuente del ADN, es importante considerar también la pureza de las muestras. Dependiendo del método de purificación y de la manipulación del ADN, la muestra puede tener contaminantes que pueden afectar la digestión enzimática. Los contaminantes pueden ser proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, CsCl, NaCl, otros tipos de ADN, nucleasas, etc. Los solventes orgánicos como el fenol, cloroformo y etanol pueden desnaturalizar las enzimas; las sales pueden disminuir la actividad; las proteínas pueden contener nucleasas que se activan con el Mg²⁺; altas concentraciones de EDTA pueden quelar el Mg²⁺ y disminuir la actividad.

Función Biológica y Nomenclatura de las Enzimas de Restricción

La función biológica de las enzimas de restricción es la protección de la bacteria contra el ataque viral, por medio de la degradación del ADN invasor, mientras que su propio material genético está protegido de la hidrólisis debido a que sus bases en los sitios de corte se encuentran metiladas.

La nomenclatura para denominar a las enzimas de restricción consiste en 3 letras que representan el nombre genérico y específico del organismo del cual se aisló; por ejemplo, EcoRI toma su nombre de Escherichia coli, “R” es la cepa y el número romano “I” indica que fue la primera que se descubrió en esta bacteria. En la Figura 11 es posible observar el corte del ADN por esta enzima.