Clonación molecular
Proceso de amplificación in vivo de secuencias de gDNA o de cDNA basada en la tecnología de DNA recombinante.
ADNc
Tipo especial de ADN obtenido in vitro, no existe, se obtiene a partir del ARN aislado de una célula, mediante retrotranscriptasa, que sintetiza ADN usando como molde ARN.
Proceso de clonación
(1) Inserción del fragmento de ADN que se quiere amplificar en una molécula portadora o vector. (2) Introducción del vector recombinante en célula viva hospedadora. (3) Selección y multiplicación en cultivo de las células que portan el ADN recombinante. (4) Recuperación del fragmento amplificado.
Ventajas
Cantidades ilimitadas, secuenciación de ADN de gran tamaño, librerías genómicas/ADNc, producción de proteínas, hormonas, y obtención de organismos transgénicos, terapia génica.
Vectores de clonación
Moléculas de ADN que se replican autónomamente en una célula huésped y que permiten la inserción de DNA extraño.
Inserto
Fragmento de DNA clonado.
Características de los vectores
Origen de replicación, sitio de inserción de DNA extraño/sitio múltiple de restricción o de clonación (Polylinker), marcador de selección, marcador de identificación.
Tipos de vectores
Bacteriófagos, cósmidos, fagémidos, cromosomas artificiales, vectores lanzadera.
Células hospedadoras
Se introducen los vectores de clonación para amplificar mediante replicación. Se cultiva en medios adecuados en los que se multiplican, dando lugar a progenie de células hijas de igual carga genética.
Células hospedadoras procariotas
Plásmidos, fagos y cósmidos.
Células hospedadoras eucariotas
Levaduras, células vegetales y células animales de insectos o mamíferos.
Secuenciación de los ácidos nucleicos
Proceso de determinación de la secuenciación de nucleótidos que componen una molécula de ADN o de ARN y que se representan por las iniciales de las bases nitrogenadas que portan.
Maxam y Gilbert
Se basa en la modificación de las bases nitrogenadas mediante reacciones químicas específicas.
Sanger
Los métodos de determinación de cadenas son métodos enzimáticos basados en las reacciones de polimerización de cadenas complementarias a la que se quiere secuenciar.
La secuenciación automática 1ª generación
Se basa en el método enzimático de terminación de cadena de Sanger y en el uso de 4 fluoróforos como marcadores.
La secuenciación a gran escala
Persigue secuenciar fragmentos mucho mayores de 1000bp e incluso genomas completos.
Secuenciación masiva
También conocida como secuenciación de 2ª generación o NGS.
Método de terminación reversible cíclica
Se basa en la utilización de dNTP marcados con un fluoróforo y bloqueados para impedir que se puedan unir más nucleótidos, actuando como terminadores de cadena.
Pirosecuenciación
Se basa en la producción de bioluminiscencia mediante reacciones enzimáticas acopladas a la incorporación de un nucleótido.