1. Introducción y Conceptos Clave

El cultivo de microorganismos (MO) consiste en proporcionar a los MO un medio favorable para su crecimiento. Esto implica que las nuevas células dispongan de nutrientes necesarios en forma adecuada para emplearlos como materiales sintéticos, una fuente de energía, temperatura adecuada, oxígeno y otros factores que sean adecuados.

El crecimiento microbiológico se define como el aumento del tamaño de su población, esto es, un aumento en el número de individuos.

Un cultivo es cualquier preparación en la que ha habido un crecimiento artificial de microorganismos, debido al desarrollo activo de los mismos en medios nutritivos, denominados medios de cultivo. Un cultivo puro es aquel en el que solo hay una especie de MO presente. Un cultivo mixto es aquel en el que hay presentes varias especies distintas de MO. Se dice que se ha aislado un MO cuando se tiene un conjunto de MO de la misma especie microbiológica separados de cualquier otro organismo vivo. El cultivo de las bacterias es necesario para aislar bacterias y así poder identificarlas.

Un medio de cultivo es un sustrato o conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos en el laboratorio. Los medios de cultivo son una mezcla equilibrada de nutrientes a concentraciones que permitan un buen crecimiento a los MO. La preparación de medios de cultivo requiere un conocimiento del MO que se siembra, así como de los ingredientes nutritivos necesarios para su crecimiento.

Los medios de cultivo deben reunir una serie de requisitos para cumplir su función:

• Contener los productos necesarios para el crecimiento del MO y las sustancias soporte en proporción adecuada para no inhibir su desarrollo.
• Utilizarse estéril.
• Estar envasados en recipientes que mantengan la esterilidad y faciliten el manejo.
• Poseer los factores clave para el desarrollo de los MO: pH, presión osmótica, temperatura, etc.

2. Necesidades Nutricionales y Ambientales de las Bacterias (MO)

Para que las bacterias puedan crecer en un medio de cultivo, se deben reunir una serie de condiciones:

• Los nutrientes que necesitan.
• Suficiente humedad en el medio y en la atmósfera.
• Una adecuada composición de la atmósfera.
• Una temperatura que permita el crecimiento.
• Un pH adecuado.
• Una concentración salina adecuada.
• No debe haber factores inhibidores: otras bacterias u hongos o sustancias que impidan el crecimiento (antibióticos, desinfectantes, metales pesados, etc.).

El proceso de nutrición es un fenómeno por el cual la célula se abastece de los elementos necesarios para sus funciones vitales. Estos elementos son los nutrientes.

2.1. Fuentes de Nutrientes

• Fuentes de carbono: La fuente de carbono utilizable va ligada al metabolismo energético y, por tanto, existen grandes variaciones. Además, las capacidades de degradación y de síntesis de los diferentes MO varían grandemente. Algunos pueden utilizar gas carbónico de la atmósfera. La mayoría necesita una fuente de carbono orgánico: sustancias simples (etanol, ácido acético…), compuestos más complejos (azúcares), proteínas o aminoácidos.
  • Autótrofas: Obtienen el carbono del CO₂.
  • Heterótrofas: Obtienen el carbono a partir de sustancias orgánicas del medio.
• Fuentes de nitrógeno: La mayor parte de los MO exige el nitrógeno combinado inorgánico, esencialmente N₃ o sales de amonio. Algunos pueden utilizar nitratos. El nitrógeno orgánico es una buena fuente.
• Fuentes de hidrógeno y oxígeno: Las mismas fuentes que las de carbono y nitrógeno y, además, el agua.
• Fuentes de azufre: Prácticamente todos los MO utilizan el azufre de los sulfatos.
• Fuentes de fósforo: Los fosfatos.
• Fuentes de metales: Los metales son utilizados en forma de iones. El K, Ca, Mg, Fe se deben añadir a los medios de cultivo. Los iones de Mn, Zn, Co, Cu, Mo están generalmente presentes en cantidad suficiente como impurezas. La concentración de los iones puede influir en el metabolismo de los MO.

2.2. Necesidades Energéticas

Las bacterias pueden estar clasificadas en cuatro categorías según la naturaleza del sustrato oxidable y el tipo de energía utilizado:

• Autótrofas: Utilizan energía química.
• Fotoorganótrofas: Utilizan energía química.
• Quimiolitótrofas: Utilizan la energía química liberada en las reacciones de oxidación de los compuestos inorgánicos.
• Quimioorganótrofas: Utilizan la energía química liberada en la oxidación o fermentación de azúcares o ácidos orgánicos.

2.3. Necesidades Específicas en Factores de Crecimiento

Algunas bacterias necesitan un número de compuestos orgánicos bien definidos, imprescindibles para su crecimiento y que no son capaces de sintetizar. Los “factores de crecimiento” son: aminoácidos, bases púricas y pirimidínicas, vitaminas.

2.4. Necesidades a veces de “Factores de Arranque”

Son esencialmente glúcidos.

3. Componentes de los Medios de Cultivo

Los medios de cultivo son sustancias complejas que deben satisfacer todas las necesidades nutritivas de los MO. Están formados por otras sustancias más sencillas. Los medios de cultivo tienen fuentes nutritivas que aportan nitrógeno:

• Extractos: Para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (p.ej., carne, hígado, cerebro, semillas) son extraídos con agua y calor, y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne (contiene bases orgánicas solubles, productos de degradación de las proteínas, vitaminas y minerales), de levadura (a partir de levadura de pan o de cerveza, es una fuente rica en aminoácidos y vitaminas del complejo B), de malta, etc.
• Peptonas: Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales minerales que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, caseína, etc.). Las peptonas son muy ricas en péptidos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Su composición variará en función del material utilizado y del método de fabricación.

Cuando los medios de cultivo son sólidos o semisólidos llevan en su composición agentes gelificantes.

• Agar: El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El componente dominante en el agar bacteriológico es un polisacárido, al que acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Un gel de agar al 1-2% en agua licua hacia los 100 ºC y se gelifica alrededor de los 40 ºC, dependiendo de su grado de pureza. Con la excepción de algunos MO marinos, el agar no es empleado como nutriente.
• Gelatina: Es una proteína. Se prepara hidrolizando colágeno en agua hirviendo. No se usa mucho porque presenta dos inconvenientes: punto de fusión bajo (22 ºC), por lo que es difícil de manejar y esterilizar; y la facilidad con que es hidrolizada por muchos gérmenes.

Además, en los medios de cultivo podemos encontrar otras sustancias diversas:

• Fluidos corporales: Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano; la más utilizada es de carnero o caballo; se utiliza para las hemólisis de estreptococos y estafilococos. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino también con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. El plasma se utiliza para demostrar la actividad coagulasa; normalmente se usa plasma humano y de conejo. El suero se prepara a partir de la sangre sin adición de anticoagulante, eliminando el líquido que se separa cuando se contrae el coágulo.
• Sistemas amortiguadores: Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Los microorganismos más comunes son neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está próximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviación del pH.
• Indicadores de pH: Indicadores ácido-base se añaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH. Deben no ser tóxicos a la concentración utilizada.
• Agentes reductores: Cisteína, tioglicolato y otros son agentes reductores que se añaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios.
• Agentes selectivos: La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo. Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sódica, telurito potásico, antibióticos, etc., a la concentración adecuada, actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.
• Bilis y sales biliares: La bilis contiene varios ácidos biliares como compuestos conjugados con aminoácidos, también contiene pigmentos como la bilirrubina y la biliverdina. Las sales biliares extraídas de la bilis, inhiben el crecimiento de organismos grampositivos y bacilos en forma de esporas, sin afectar a los bacilos entéricos gramnegativos.