Introducción a los Cultivos Celulares

El cultivo celular se refiere al cultivo in vitro de células, es decir, el cultivo de células viables que pueden crecer y reproducirse en recipientes de laboratorio de diversos materiales, como vidrio o plástico. Los cultivos celulares in vitro se clasifican en:

• Cultivos microbianos
• Cultivos de células animales (equivalente a cultivo celular normal)
• Cultivos de células vegetales

Cultivos Celulares Animales

En los cultivos celulares animales se incluyen:

1. Cultivos de órganos: Técnica que mantiene y estudia órganos completos conservando su estructura funcional.
2. Cultivos de tejidos o explantes: Un fragmento de tejido se coloca en la interfase sólido-líquido de un soporte y las células de la periferia migran y proliferan.
3. Cultivos de células disgregadas: Se aíslan células individuales mediante métodos enzimáticos y mecánicos, perdiendo las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular, con posibilidad de cultivo en suspensión o monocapa.
4. Cultivos organotípicos: Simulan el comportamiento de un órgano con interacción entre varios tipos celulares para recrear tejidos u órganos funcionales.
5. Cultivos histotípicos: Se cultiva un solo tipo celular, logrando una alta densidad celular.

Obtención de Células para Cultivos Celulares

Consiste en separar la matriz extracelular que mantiene unidas a las células.

• Métodos mecánicos: Utilizar un homogeneizador de tejidos o tratar con enzimas proteolíticas.

Métodos para separar:

• La centrifugación, que separa por tamaño.
• La capacidad de adherencia al vidrio o al plástico.
• La unión a ciertos anticuerpos específicos.
• La unión a ciertos anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes.
• La disección de un grupo de células a partir de una sección de tejido preparada para microscopía.

Técnicas de Cultivos Celulares

Existen dos técnicas principales:

• Cultivo en suspensión: Las células proliferan dispersas sin necesidad de soporte sólido.
• Cultivo en monocapa: Las células crecen adheridas a una superficie sólida como plástico o vidrio, siendo este último el método más popular para células no hematopoyéticas.

Cultivos Primarios y Secundarios

Un cultivo primario inicia con células disgregadas de tejido que se incuban a 37°C en una atmósfera rica en CO₂. Los subcultivos trasladan las células a nuevos recipientes con medio fresco para extender la proliferación y desarrollar líneas celulares homogéneas.

Los subcultivos repetidos estabilizan las líneas celulares, destacando las siguientes características:

• Aumento del número de células.
• Predominio de tipos celulares con mayor tasa de crecimiento.
• Homogeneidad.
• Capacidad de conservación indefinida en nitrógeno líquido.

La proliferación en cultivos secundarios depende del tipo celular y condiciones específicas. A partir del tercer subcultivo, el cultivo se estabiliza y homogeneiza. Las líneas celulares pueden ser finitas, con división limitada, o infinitas, como las tumorales, que evitan este proceso mediante activación de telomerasa o inactivación de puntos de control del ciclo celular.

Metodología Operativa en Fases o Subcultivos

1. Observación microscópica para verificar confluencia.
2. Eliminación del medio de cultivo.
3. Lavado con PBS.
4. Tratamiento con tripsina para liberar las células.
5. Inactivación de tripsina.
6. Recolección en suspensión.
7. Dilución con medio fresco.
8. Redistribución en nuevos recipientes.

Materiales y Equipos en Cultivos Celulares

Recipientes en Cultivos Celulares

Se utilizan recipientes de plástico estériles, como placas Petri, placas multipocillo, frascos T, frascos triples, botellas cilíndricas, biorreactores y tanques con agitación. Estos recipientes aseguran el intercambio gaseoso y la disponibilidad de nutrientes.

Medios de Cultivo

Los medios definidos actuales, como el Minimal Essential Medium (MEM), incluyen glucosa, aminoácidos, sales minerales, vitaminas, proteínas como insulina o transferrina, y factores de crecimiento. Se tamponan para mantener un pH de 7.4, empleando bicarbonato-CO₂ o HEPES, e incluyen indicadores de pH como rojo de fenol y suplementos como suero y antibióticos.

Equipos de Investigación

Las incubadoras mantienen condiciones de temperatura (37°C), concentración de CO₂ (5-10%) y humedad relativa para el crecimiento celular. El CO₂ regula el pH del cultivo mediante la formación de bicarbonato, asegurando un ambiente adecuado para el desarrollo celular.

Introducción a los Cultivos Celulares Vegetales

La Revolución Verde se basó en la selección sistemática de especies vegetales con mejores propiedades mediante autopolinización y polinización cruzada, apoyándose en la reproducción sexual. Por otro lado, la biotecnología vegetal, centrada en cultivos celulares vegetales, emplea la reproducción asexual de plantas mediante cultivo in vitro de tejidos vegetales e incluye técnicas de ingeniería genética y biología molecular.

Estos cultivos se fundamentan en la totipotencialidad celular, característica de células no diferenciadas capaces de generar tejidos nuevos o individuos completos. Los meristemos, tejidos ricos en células meristemáticas, se encuentran en yemas y otras partes de la planta, como tallos, raíces y hojas.

Totipotencialidad Celular

Este proceso, conocido como morfogénesis, genera nuevas plantas u órganos a partir de células meristemáticas. Estas células son más abundantes en plantas jóvenes de rápido crecimiento y pueden estar en meristemas primarios o apicales (crecimiento de raíces o brotes), secundarios o axilares (tallos o ramas) y adventicios (áreas como tallos u hojas). Los meristemas suelen estar protegidos por tejidos diferenciados como primordios foliares que forman yemas apicales, axilares o adventicias, responsables del crecimiento de la planta.

Cultivos Celulares Vegetales sobre Medio de Cultivo Sólido en Placa o Tubo

El cultivo in vitro inicia con un explante de la planta depositado en un medio nutritivo estéril semisólido. Este procedimiento puede incluir explantes de meristemos apicales, tallos o ramas para micropropagación, técnica rápida y económica para obtener muchos individuos, o explantes de hojas, tallos o raíces para procesos de morfogénesis.

Morfogénesis

Puede ser:

• Directa: Las células meristemáticas del explante forman directamente órganos (organogénesis) o embriones somáticos (embriogénesis), que no requieren reproducción sexual.
• Indirecta: Células diferenciadas se desdiferencian formando un callo de células indiferenciadas con rápido crecimiento.

Medios de Cultivo e Incubación

Los medios de cultivo incluyen macro y micronutrientes esenciales, fuentes de carbono como glucosa, agentes gelificantes como agar y hormonas reguladoras del crecimiento (auxinas y citoquininas). La temperatura ideal es de 25-28°C, con fotoperíodo ajustable y alta humedad.

Cultivo de Meristemos

Es útil para obtener plantas libres de virus y multiplicar especies con reproducción lenta.

Micropropagación

Técnica de propagación clonal in vitro usada para producir en masa especies hortícolas, medicinales, frutícolas y ornamentales, permitiendo automatización y selección de individuos valiosos.

Cultivos Celulares Vegetales en Suspensión

Se realiza con células individuales en medio líquido dentro de un biorreactor. Estas células se obtienen mediante disgregación de callos o generación de protoplastos usando enzimas como pectinasas y celulasas.

Cultivos Vegetales Genéticamente Modificados

La modificación genética de células vegetales utiliza técnicas como la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens, que transfiere genes de interés a través de un plásmido Ti, y la biobalística, donde micropartículas recubiertas con ADN son proyectadas sobre las células. Estas células transformadas proliferan y desarrollan plantas con propiedades mejoradas.