ELECTROFORESIS CAPILAR

Fundamentos: Técnica de separación en la que las sustancias se separan dependiendo de la movilidad que adquieren, en el seno de un electrolito, bajo la acción de un campo eléctrico. Sigue la Ley de Ohm (V=IR). Existen dos tipos:

• Electroforesis clásica: en disolución, en tubos estrechos, sobre papel, acetato de celulosa, sobre gel (en placas o en columnas).
• Electroforesis capilar: en el interior de un capilar de sílice fundida. Permite separar, identificar y cuantificar un gran número de compuestos de forma rápida y eficaz.

Características:

• Alta velocidad de separación.
• Alta eficacia (100,000-500,000 platos teóricos).
• Pequeñas cantidades de muestra (1-10 nl de muestra).
• Consumo mínimo de reactivos.
• Aplicable a un número muy amplio de analitos, tanto iónicos como moleculares.
• Fácilmente automatizable.

Influencia del pH: El pH del electrolito es clave en la separación, ya que determina el grado de movilidad de los diferentes analitos. La separación se lleva a cabo según la relación masa/carga de las distintas moléculas. Para que esto sea posible, es necesario aplicar una diferencia de potencial (de 100 a 500 V/cm) entre los dos extremos del capilar, que hará que las moléculas se muevan hacia un extremo u otro del capilar (movilidad electroforética: las moléculas catiónicas hacia el polo negativo y las aniónicas hacia el polo positivo) y que se vayan separando entre sí.

Además, existe dentro del capilar otro fenómeno denominado flujo electroosmótico que se da debido a que la superficie interna del capilar está cargada. El flujo electroosmótico es el mismo dentro de todo el capilar y afecta de igual forma a todas las moléculas, arrastrándolas hacia uno de los extremos. Así, la separación se verá afectada por el flujo electroosmótico y por la movilidad electroforética de cada una de las moléculas. Este aumenta con el pH y concentración de electrolito.

Inversión del flujo electroosmótico:

• Cambiando la polaridad del campo eléctrico.
• Añadiendo un agente tensioactivo para invertir la polaridad de la pared del capilar y el sentido del flujo electroosmótico.

INSTRUMENTACIÓN:

-Fuente de alimentación: gran potencia, alto voltaje, aisladas y estabilizadas, y posibilidad de invertir la polaridad.

-Tubo capilar: Relleno de tampón, hace de puente de contacto uniendo el cátodo y el ánodo y cerrando el circuito eléctrico. Capilar ideal: químicamente y eléctricamente inerte, buena conductividad térmica, baja fluorescencia, transparente a radiación UV, flexible, fuerte y termostatizado, disponible en altos rangos de longitud y diámetro.

-Celdas electroforéticas: Dos viales rellenos de disolución tampón donde se introducen los extremos del capilar y los electrodos (Pt) conectados al campo eléctrico. Vial de muestra: En él se introduce un extremo del capilar para la inyección: inyección hidrodinámica (vacío, presión, sifonación) e inyección electrocinetica.

El volumen de muestra inyectado oscila entre 20 – 100 nl dependiendo de las dimensiones del capilar.

-Sistemas de detección: permiten detectar y cuantificar las diferentes fracciones de la muestra. Son prácticamente los mismos que en HPLC. Los más usados son: absorción UV-V (directa/indirecta), fluorescencia UV-V (directa/indirecta) y espectrometría de masas. Los menos usados: conductividad, amperometría, índice de refracción, radiométricos.

-Procesador y presentador de señales: permite introducir instrucciones, variar parámetros, interpretar lecturas del detector, realizar cálculos y presentar datos mostrando el electroferograma resultante del análisis. El electroferograma es una representación gráfica de la señal de respuesta del detector a los analitos frente al tiempo de migración de los mismos desde la inyección de la muestra. Los picos muestran información cualitativa (posición) y cuantitativa (área).

TIPOS:

-Electroforesis capilar de zona (CZE): Se emplea para la separación y determinación de especies iónicas. Las especies neutras se eluyen conjuntamente. La separación depende de la movilidad de los iones. Los aniones se pueden determinar si el flujo electroosmótico es mayor que la movilidad electroforética. Es posible invertir el flujo electroosmótico.

-Cromatografía capilar electrocinetica micelar (MEKC): Separa tanto especies cargadas como neutras combinando el movimiento electroforético y la separación cromatográfica. Se añade un tensioactivo para formar micelas de carga superficial negativa. Las micelas se mueven hacia el cátodo debido a que el flujo electroosmótico es mayor que la movilidad electroforética. Las especies se separan debido a su distribución entre las micelas (FE) y el tampón (FM). Sirve para la determinación de sustancias de bajo PF como fármacos, drogas, aditivos y plaguicidas.

-Electroforesis capilar sobre gel (CGE): La separación se basa en la diferencia de tamaño y carga. Para relaciones carga/masa semejantes, la separación se basa únicamente en el tamaño. Al capilar, además del tampón, se le adiciona un gel. Inyección electrocinetica de la muestra. Se aplica a la separación de grandes biomoléculas (fragmentos de ADN, proteínas, nucleótidos y polisacáridos).

-Isotacoforesis capilar (CITP): Separación de especies iónicas, ausencia de flujo electroosmótico. Se rellena el capilar de electrolito frontal (movilidad mayor que los analitos). Se inyecta la muestra. Se sitúa un electrolito terminal en otro vial. La separación es debida a la movilidad electroforética. No hay electrolito de soporte, las bandas deben permanecer adyacentes para no cortar la corriente.

–Isoelectroenfoque capilar (CIEF): Separación de analitos anfóteros en función de sus puntos isoeléctricos. Ausencia de flujo electroosmótico. Se rellena el capilar de un anfolito soporte y los solutos. Se aplica el campo de modo que el anfolito soporte genera un gradiente de pH. Los solutos se enfocan en la zona de pH igual a su punto isoeléctrico. Se fuerza a salir el contenido del capilar hacia el detector.

APLICACIONES:

Compuestos con diferente relación carga/tamaño –> CZE (pequeños iones, pequeñas moléculas, péptidos y proteínas).

Compuestos neutros con diferente polaridad –> MEKC (pequeñas moléculas, péptidos, nucleótidos).

Compuestos con diferente tamaño e igual relación carga/tamaño –> CGE (péptidos, proteínas, nucleótidos, ADN).

Biomoléculas con semejante tamaño y relación carga/tamaño pero diferentes puntos isoeléctricos –> CIEF (péptidos y proteínas).

-Análisis biofarmacéutico: control de calidad, determinación de principios activos, separaciones quirales.

-Análisis clínico: metabolitos en fluidos biológicos, monitorización de drogas, análisis forense, marcadores tumorales.

-Análisis bioquímico: separación de proteínas, separación de ácidos nucleicos y secuenciación de ADN.

-Análisis de alimentos: aminoácidos, glúcidos, ácidos grasos, aditivos y productos de degradación.

-Análisis ambiental: pesticidas, metales pesados, hidrocarburos, control de calidad de aguas.