Electroforesis: Separación de Biomoléculas

La electroforesis es un método analítico semipreparativo que se utiliza para separar biomoléculas en función de su carga y bajo la acción de un campo eléctrico.

Factores que Afectan la Calidad y Eficiencia de la Separación

Campo Eléctrico

El campo eléctrico es el causante del movimiento de las moléculas. Depende de:

• Diferencia de potencial entre los electrodos.
• La resistencia del gel.
• La resistencia de la disolución tampón.

Matriz del Gel

Su dureza define el rango de separación, en función de la concentración del monómero (agarosa, acrilamidas) en la disolución inicial.

Moléculas

Dentro de ciertos límites:

• Su tamaño afecta su movilidad.
• Su conformación topológica también influye.
• Su composición de base o secuencia no afecta a su movilidad.

Temperatura

Si se eleva demasiado, afecta la calidad de la separación. Depende de:

• La intensidad de la corriente.
• La resistencia al paso de la misma.
• Eliminación de calor mediante placas metálicas y refrigeración externa o por el propio tampón (geles sumergidos).

Solución Tampón

Mantiene constante el pH de la solución y las cargas de las muestras. Aporta iones para el paso de la corriente.

Electroforesis Vertical con Geles de Poliacrilamida (PAGE)

Se utiliza casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (más resistente físicamente) para proteínas o ácidos nucleicos de pequeño tamaño.

Métodos de Tinción

Las proteínas separadas mediante PAGE pueden ser visualizadas en el gel mediante diversos métodos de tinción: fluorescencia, plata y azul coomassie, siendo este último el más utilizado.

Enzimas de Restricción

Las enzimas de restricción son enzimas que reconocen secuencias específicas de la molécula de ADN, uniéndose a ellas y rompiendo los enlaces fosfodiéster. Esta rotura puede ser de dos formas. Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como mecanismo de defensa.

Tipos de Enzimas de Restricción

• Tipo I: Función de Restricción y Modificación (metilan). Cortan a cierta distancia de la secuencia que reconocen. Requieren ATP para moverse a través de la molécula.
• Tipo II: Solo función de Restricción. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen. No requieren ATP (solo necesitan Mg++ como cofactor).

Enzimas de Restricción y Aplicaciones

• Elaboración de Mapas de restricción.
• Fragmentación de ADN para separación por Electroforesis.
• Fragmentos como sondas marcadas en “Southern Blotting”.
• Análisis de Restricción.
• Creación de ADN recombinante.

Análisis de Restricción

• Es el análisis de una molécula de ADN empleando digestión con enzimas de restricción y corridas electroforéticas.
• Digestión de ADN puro con enzimas de restricción.
• Aplicación del digerido y del marcador de peso molecular en pocillos próximos en el gel de agarosa.
• Desarrollo de la electroforesis, teñido del gel con bromuro de etidio, iluminación con LUV y fotografiado de las bandas obtenidas.
• Estudio del Patrón de Bandas obtenido y comparación con los marcadores, para la deducción del tamaño de los fragmentos.

Fases del Análisis de Restricción

• Preparación de la mezcla de digestión: (ADN puro, enzima, solución tampón, agua destilada).
• Incubación: temperatura óptima (1 hora a 2 horas).
• Detención de la reacción: Solución Stop 5 min a 4 ºC.
• Aplicación del digerido y el marcador en pocillos próximos en el gel de agarosa.
• Desarrollo de la electroforesis (aproximado a 80V de 60 a 90 min).
• Teñido del gel: (Solución Bromuro de etidio de 5 a 10 minutos).
• Fotografía del gel bajo LUV o almacenamiento digital.
• Deducción del tamaño de los fragmentos.

Marcador Genético

• Identifican en un individuo las características del fenotipo, genotipo o de ambas.
• El seguimiento de la herencia de los marcadores puede realizarse de generación en generación.

Tipos de Marcadores Genéticos

• Marcadores morfológicos.
• Marcadores proteicos (bioquímicos).
• Marcadores de ADN.

Marcadores Morfológicos

Ventajas

• Fácilmente disponibles.
• Evaluación requiere, generalmente, equipo sencillo.
• Constituyen la medida más directa del fenotipo.

Desventajas

• Requiere de un conocimiento práctico del cultivo o de la especie.
• Están sujetos a influencias ambientales.
• Su número es limitado.

Marcadores Proteicos

Se basan en las propiedades de migración de las proteínas, las cuales permiten separarlas mediante electroforesis. Se detectan mediante ensayos histoquímicos específicos.

Ventajas

• Requieren de un equipo de laboratorio relativamente sencillo.
• Son un valioso complemento de la evaluación morfológica.

Desventajas

• Están sujetos a influencias ambientales.
• Su número es limitado.

Marcadores de ADN

Son polimorfismos detectados en la secuencia del ADN del núcleo o de los orgánulos.

Ventajas

• Su número es, potencialmente, ilimitado.
• No están sujetos a influencias ambientales.
• Son una medida objetiva de la variación.

Desventajas

• Se necesita de un equipo técnicamente más complejo.

Propiedades Deseables de los Marcadores Genéticos

• Altamente polimórficos.
• Reproducibles.
• Co-dominantes.
• Distribuidos de manera uniforme en el genoma.
• Discriminantes.
• No sujetos a influencias ambientales.
• Neutrales.