Endonucleasas de Restricción, Polimerasas y Enzimas Asociadas a los Ácidos Nucleicos
Las endonucleasas de restricción son un conjunto de enzimas bacterianas que actúan como nucleasas que cortan el ADN, conocidas como tijeras moleculares. Estos fragmentos de ADN los conocemos como fragmentos de restricción, usados para la posibilidad de modificar genes de los organismos.
Tipos de Restricción
Tipo I: Reconocen y cortan la secuencia de ADN a una distancia prudencial de la zona de reconocimiento. Se necesita ATP para poder moverse y de Mg+2 y SAM como cofactores, realiza el proceso de metilación.
Tipo II: Hacen el corte en el lugar del reconocimiento o en zonas muy cercanas. Son las más usadas ya que son muy específicas y no necesitan ATP, solo Mg+2.
Tipo III: Necesita de dos secuencias de reconocimiento para realizar el corte, hecho a una distancia considerable del lugar escogido, necesita ATP, Mg+2 y SAM.
Algunos factores pueden afectar a la hora de utilizar las enzimas de restricción, ya que pueden modificar su actividad:
Pureza del ADN: Necesidad de que sea muy puro para realizar el corte. Una cantidad excesiva de fenol, etanol o EDTA puede inhibir la actividad enzimática de las nucleasas de restricción.
Temperatura y pH: Están directamente relacionados con la actividad enzimática, ya que una modificación de rangos inhibe la acción enzimática.
Presencia de ADNasa: Puede degradar el ADN en presencia de Mg+2, ya que las enzimas de restricción la usan como cofactor.
Contaminantes con carga negativa: La modificación de la carga del entorno del material genético puede provocar la inhibición de la actividad enzimática.
ADN contaminado: Puede provocar que no se hagan los cortes por la enzima de restricción debido a la especificidad.
Grado de metilación: Según las enzimas que se encuentren, pueden prohibir la metilación tras el corte.
Estado de la molécula de ADN: No se puede realizar el corte si no se encuentra accesible para las enzimas de restricción o si no se introduce la porción en la zona de restricción de la enzima.
Usar el buffer correcto: El uso de uno erróneo genera un cambio de pH y desnaturaliza la enzima de restricción.
Cada enzima de restricción tiene asignado un nombre según la bacteria que sea el origen de la misma. Para definir el nombre de una enzima de restricción se utiliza la siguiente nomenclatura:
Tres letras iniciales.
Nombre de la cepa.
Número para distinguir las distintas nucleasas de restricción.
Si es enzima de restricción se usa “R” y de metilación “M”, se omite.
En investigación tienen el uso de insertar genes en distintas zonas de ADN. Hay 4 tipos:
ADN ligasa I: Une la hebra rezagada formada por fragmentos de Okazaki.
ADN ligasa II: Repara el ADN si está dañado.
ADN ligasa III: Empalma ADN por la escisión de nucleótidos y la recombinación.
ADN ligasa IV: Repara la rotura de la estructura de la doble hélice.
Importancia en las técnicas de manipulación y análisis de las moléculas de ADN:
Cartografía del genoma: Conocer la ubicación y composición de todos los genes del ser humano.
Diagnóstico de enfermedades: Uso de ingeniería genética para diagnosticar enfermedades con mayor celeridad antes de que se presenten síntomas.
Identificación: Identificar a gente mediante su ADN al haber material genético propio.
Terapéutica: Reparar genes defectuosos.
Biotecnología: Modificar algunas especies según intereses.
Las mutaciones son modificaciones en la información genética, cualquier cambio en la secuencia de ADN de una célula; son las causas de la evolución. Pueden ser beneficiosas, neutrales o negativas.
En células embrionarias es más fácil que se den errores de replicación ya que la velocidad del proceso es más rápida.
Agentes Mutágenos
Hay 3 agentes mutágenos:
Biológicos: Organismos vivos que son capaces de producir cambios en la información genética de la célula hospedadora, dado en bacterias, hongos y virus.
Químicos: Agentes químicos capaces de producir cambios en la estructura del ADN.
Físicos: Modifican la estructura del ADN y producen mutaciones, dadas por radiaciones alfa y ultravioleta y temperatura.
Clasificación de las Mutaciones según el Tamaño
Las mutaciones se pueden clasificar según el tamaño:
Extensas: Gran número de bases, +3.
Puntuales: Cambio de 1-3 nucleótidos.
Clasificación de las Mutaciones según el Cambio Estructural
Las mutaciones se pueden clasificar según el cambio estructural:
Silenciosas: Cambio de una de las bases del ADN pero codifica el mismo aminoácido.
Inserciones: Añade 1 o + bases del ADN original alterando el marco de lectura de la proteína.
Deleciones: Pérdida 1 o + bases en el ADN alterando la cadena codificante de la proteína.
Duplicaciones: Altera la formación de la cadena de aminoácidos.
Clasificación de las Mutaciones según el Efecto sobre el ADN
Las mutaciones se pueden clasificar según el efecto que produzcan sobre el ADN:
Sin sentido: Cambio en un par de bases de la secuencia da lugar a un codón de terminación, provocando una mutación más corta.
Cambio de sentido: Cambio de un solo par de bases produciendo un aminoácido diferente al que se encuentra por lo habitual en esa posición.
Conocemos como polimorfismo las diferentes variaciones de un alelo. Empezamos a considerarlo polimorfismo cuando hay 1% de la población que lo padece. Hay estos tipos:
STR o microsatélites: Secuencias cortas de nucleótidos (2-6) repetida en varios intervalos, según el número de variaciones de repeticiones crea diferentes alelos, usados como marcadores moleculares en una gran variedad de aplicaciones en el campo de la genética.
Polimorfismo de nucleótido único (SNP): Un nucleótido dentro de la secuencia genómica que se puede encontrar tanto en la parte codificante como la no codificante del genoma.
Cromosoma Y: Transmisión por vía paterna.
CNV: Variación en el nº de copias de un segmento específico de ADN.
Pequeño polimorfismos de inserción/deleción: Deleción o inserción de un fragmento pequeño de ADN (10mil pares de bases máx.).
RFLP: Cambio de algún nucleótido en la zona de restricción.
ADN mitocondrial: Circular, bicatenario, sin extremos y muchas copias (+ mil) en cada mitocondria. Muy útil para establecer relaciones maternales entre distintas personas.
InDels: Inserción o deleción de tan solo 1 nucleótido o de escasos nucleótidos. Se encuentra con frecuencia en las regiones no codificantes y apenas se encuentran en las zonas codificantes.