Estructura del ADN: Características Clave

El ADN, o ácido desoxirribonucleico, es la molécula fundamental de la vida. Su estructura, elucidada por Watson y Crick, explica cómo se almacena y transmite la información genética. A continuación, se describen las características principales de esta estructura:

1. Doble Hélice Dextrógira: El ADN está formado por dos cadenas de polinucleótidos enrolladas alrededor de un eje imaginario común, formando una doble hélice que gira hacia la derecha.
2. Cadenas Antiparalelas: Las cadenas tienen polaridad opuesta (son antiparalelas). Discurren con direcciones opuestas: una en sentido 5’→3′ y la otra en sentido 3’→5′.
3. Esqueleto Pentosa-Fosfato Exterior, Bases Nitrogenadas Interiores: El esqueleto de pentosa-fosfato se encuentra en el exterior de la hélice, lo que le permite interactuar con el agua. Las bases nitrogenadas se sitúan en el interior, con sus planos perpendiculares al eje de la hélice.
4. Apareamiento de Bases por Puentes de Hidrógeno: Las bases de una cadena interactúan con las bases de la otra cadena mediante puentes de hidrógeno. Los únicos apareamientos permitidos son A (adenina) con T (timina) y G (guanina) con C (citosina).
5. Complementariedad de Cadenas: Las cadenas son complementarias entre sí. Siempre que hay una A en una cadena, se encuentra una T en la otra, y lo mismo ocurre con G y C.
6. Dimensiones de la Hélice: La hélice tiene un diámetro de 20 Å (angstroms). El paso de rosca es de 10 nucleótidos por vuelta, y la hélice da una vuelta completa cada 34 Å.
7. Surcos Mayor y Menor: La hélice presenta dos surcos de distinto ancho: un surco mayor de 22 Å y un surco menor de 12 Å.

Técnicas de Cromatografía para la Purificación de Ácidos Nucleicos

La cromatografía es una técnica fundamental para separar y purificar biomoléculas, incluidos los ácidos nucleicos. A continuación, se describen varios tipos de cromatografía utilizados en la manipulación del ADN y ARN:

Cromatografía de Intercambio Iónico

Esta técnica utiliza una resina cargada (fase estacionaria) para separar moléculas según su carga. Para la purificación de ácidos nucleicos, que tienen carga negativa debido a los grupos fosfato, se utilizan resinas de intercambio aniónico cargadas positivamente, como la dietilaminoetil (DEAE)-celulosa.

El proceso implica la interacción de los ácidos nucleicos con la resina. Al añadir un tampón de elución, los iones del tampón compiten con los ácidos nucleicos por los sitios de unión en la resina, permitiendo la elución (liberación) de los ácidos nucleicos.

Cromatografía de Absorción

Se basa en las interacciones entre una fase estacionaria y una fase móvil. Las moléculas de la muestra interactúan con la fase estacionaria de forma diferencial según sus propiedades químicas (afinidad, carga, polaridad). La separación del ADN se produce gracias a:

• Carga negativa: Grupos fosfato en la estructura del ADN.
• Interacciones hidrofóbicas: Debido a las bases nitrogenadas.
• Interacciones específicas: Columnas preparadas para interactuar con nucleótidos o la doble hélice.

Cromatografía de Afinidad con Oligo(dT)-Celulosa

Esta técnica se utiliza específicamente para purificar ARN mensajero (ARNm) poliadenilado. Muchos ARNm eucariotas tienen una cola de poli(A) en su extremo 3′. Se utiliza una columna con oligo(dT)-celulosa como fase estacionaria. El ARNm se une a la columna a través de su cola de poli(A), mientras que otros tipos de ARN no se unen. El ARNm se eluye posteriormente aumentando la fuerza iónica del tampón de elución.

Plásmidos: Definición y Purificación

Plásmido: Molécula circular de ADN extracromosómico presente en bacterias, capaz de replicarse de forma independiente.

Pasos para la purificación de plásmidos:

1. Cultivo bacteriano: Las bacterias que contienen el plásmido se cultivan en un medio adecuado.
2. Selección: Se cultivan las bacterias en un medio con un antibiótico (por ejemplo, tetraciclina). Solo las bacterias que contienen el plásmido con el gen de resistencia al antibiótico sobreviven.
3. Extracción a pequeña escala (Método Alcalino): Se utiliza una solución de NaOH y SDS (dodecilsulfato sódico) para lisar (romper) las células. La neutralización con acetato de potasio precipita las proteínas y el ADN cromosómico. El ADN plasmídico permanece en el sobrenadante.
4. Electroforesis (Esquema): Se realiza una electroforesis en gel de agarosa para visualizar el ADN plasmídico. Se observan bandas correspondientes al plásmido superenrollado (migración más rápida), relajado y, posiblemente, formas lineales.
5. Concentración y Pureza: La concentración de ADN se mide mediante la absorbancia a 260 nm (A260). La pureza se evalúa mediante la relación A260/A280 (un valor cercano a 1.8 indica una buena pureza).

Electroforesis en Gel: Agarosa Convencional vs. PFGE

La electroforesis en gel es una técnica crucial para separar fragmentos de ADN según su tamaño. Existen dos variantes principales:

Electroforesis Bidimensional de Proteínas

La electroforesis bidimensional es una técnica que combina dos tipos de electroforesis para separar proteínas con alta resolución. Se basa en dos parámetros principales:

• Punto isoeléctrico (pI): Carga neta de la proteína.
• Tamaño/Peso molecular:

Proceso:

1. Isoelectroenfoque (IEF): Las proteínas se separan según su punto isoeléctrico en un gradiente de pH.
2. SDS-PAGE: Después del IEF, el gel se gira 90° y se realiza una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) en condiciones desnaturalizantes. Las proteínas se separan según su tamaño.

Resultado: Un mapa bidimensional donde la mayoría de las proteínas están separadas. Esta técnica es muy útil para caracterizar proteínas desconocidas.