Enzimas de Restricción

Las enzimas de restricción son nucleasas que, junto con las metilasas, forman un sistema de defensa en bacterias. Su estructura puede ser:

• Bifuncional con 2 subunidades.
• Bifuncional con 3 subunidades.

Lugar de reconocimiento: Secuencias cortas y capicúa, a menudo asimétricas de 5-6 pares de bases.

Necesidad de ATP para la restricción: No, sí, sí (dependiendo del tipo de enzima).

Restricción y metilación: Reacciones separadas, mutuamente excluyentes o conjuntas.

Librería de ADN

Una librería de ADN es un conjunto de clones obtenidos a partir de los ARNm de un tejido u órgano. El análisis secuencial y regulado de las poblaciones de ARNm durante el desarrollo de un organismo puede ser estudiado mediante ADN copia (ADNc), obtenido a partir de un ARNm y un cebador por la acción de la transcriptasa inversa.

Proceso de Clonación

La clonación es la introducción de material genético manipulado en una célula, de modo que pueda replicarse y ser transferido a sus descendientes. Los elementos necesarios son:

• ADN exógeno.
• Un vector (plásmido bacteriano o cósmido).
• Enzimas de la célula huésped para iniciar la replicación.

Transformación Genética

La transformación genética es el proceso por el cual ciertas bacterias competentes incorporan ADN exógeno del medio. La capacidad de captar ADN y conservarlo depende de un sistema de ADN específico asociado a la membrana. Ejemplo: Streptococcus pneumoniae. Este proceso se utiliza para introducir experimentalmente ADN extraño, como un plásmido, en una bacteria para que adquiera un fenotipo de interés. Las bacterias también pueden ser transformadas con ADN viral (transfección).

Mutaciones

Mutación Silenciosa

Ejemplo: ADN 5′ CAC CGA 3′ cambia a CAC TGA. El ARNm 5′ CAC CGA cambia a CAC UGA. El codón UGA se convierte en una señal de terminación, resultando en una proteína incompleta y no funcional.

Mutación Supresora

Una mutación supresora ocurre cuando un producto proteico defectuoso es corregido por una segunda mutación en otro sitio del genoma, restaurando el fenotipo original. Ejemplo: cat cat cat cat ccat.

Técnica Southern Blot

El ADN se digiere con enzimas de restricción, los fragmentos se separan por electroforesis en agarosa y se transfieren a un filtro de nitrocelulosa o nylon. La transferencia se realiza por vacío o capilaridad con un tampón de alta fuerza iónica. El ADN se fija al filtro por calor (80°C) o irradiación UV. El filtro se hibrida con una sonda marcada en presencia de secuencias no complementarias (SDS-Ficol) para evitar uniones inespecíficas. Tras la hibridación, el filtro se lava con tampones de fuerza iónica decreciente para eliminar la sonda no hibridada.

Inconveniente de la ADN Polimerasa en E. coli para PCR

La ADN polimerasa de E. coli se inactiva a las temperaturas necesarias para la desnaturalización del ADN, requiriendo añadir nueva enzima en cada ciclo. La solución es usar la ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), que es termoestable (72°C).

Características de la ARN Polimerasa

Las ARN polimerasas leen una molécula de ADN y sintetizan una molécula de ARN complementaria. Requieren un promotor como señal de inicio de la transcripción, pero no necesitan cebador. Se han purificado de diversos organismos.

Predicción de Mutaciones Dirigidas en PCR

Se pueden predecir mutaciones mediante cebadores con desajustes puntuales respecto a las secuencias originales. Esto permite introducir cambios específicos y estudiar la función de zonas concretas de una proteína.

Verdadero o Falso (Bioseguridad y Radiaciones)

• Falso: Los métodos de bioseguridad buscan reducir la exposición a materiales biológicos infecciosos.
• Falso: Los radioisótopos son químicos, pero su peligro radica en la radiación que emiten.
• Verdadero: Los niveles de seguridad biológica van del 1 al 4.
• Falso: Los centros que manipulan radioisótopos tienen categorías de diseño y señalización según normativa.
• Verdadero: Las vías de transmisión de agentes biológicos son respiratoria, ocular, digestiva, dérmica y parenteral, requiriendo un plan de prevención específico.
• Verdadero: La gestión de residuos radiactivos y planes de emergencia se encuentran en el plan de protección radiológica.
• Verdadero: La exposición a radiaciones no ionizantes (UV) requiere medidas de seguridad como protectores y equipos de protección personal.