Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos

A modo genérico, el protocolo para la extracción de ácidos nucleicos purificados comprende tres pasos:

1. Pretratamiento de la muestra.
2. Extracción de los ácidos nucleicos.
3. Purificación de los ácidos nucleicos.

Pretratamiento de la Muestra

Los ácidos nucleicos se pueden obtener prácticamente de cualquier muestra biológica. Por ello, en muchas ocasiones es necesario realizar un pretratamiento específico de la misma que nos permita obtener suspensiones celulares sobre las que se realizará la extracción y purificación de ácidos nucleicos.

Sangre

• La sangre es una de las muestras más utilizadas para la extracción de ácidos nucleicos a partir de leucocitos.
• Muchos de los componentes celulares interfieren en las técnicas de biología molecular: La hemoglobina es un potente inhibidor de la PCR, por lo que es necesaria su eliminación mediante la lisis de los hematíes.
• Para la obtención de ácidos nucleicos de una muestra de sangre se tiene que partir de sangre entera, anticoagulada con EDTA, heparina o citrato sódico. EDTA también inhibe la PCR.
• Es conveniente que la extracción de los ácidos nucleicos se realice en las 24 horas siguientes a la obtención de la muestra.
• Si esto no es posible, se puede conservar la muestra en refrigeración, durante 5 días, a 4 ºC.
• En caso de tener que aplicar otro tipo de técnicas en las que se requiere ADN sin fragmentar, Southern Blot, la sangre no se debe almacenar en nevera más de 3 días (degradación y fragmentación de ADN).

Cultivos Celulares

Es un método de obtención de células in vitro mediante siembras controladas en medios controlados.

• A partir de cultivos celulares se pueden realizar estudios genómicos y de expresión génica, bajo determinadas condiciones.
• Antes de realizar la extracción de ADN debemos realizar una recolección de células.
• Para realizar esta recolección:
  • Si las células crecen en suspensión en el medio de cultivo, se recolecta directamente del tubo de cultivo.
  • Si las células crecen en monocapa, adheridas a la pared del frasco, bien se puede utilizar el propio frasco para realizar el proceso de extracción, o bien se pasa la monocapa a un tubo.

Tejidos Animales o Vegetales Frescos

Para obtener ácidos nucleicos a partir de este tipo de muestras se requiere un tratamiento previo. La cantidad de tejido a homogenizar va a depender de:

• El tipo de tejido.
• El método de homogenización utilizado.
• El procedimiento de extracción y purificación de los ácidos nucleicos.

La homogenización puede ser mecánica (mortero) o química (consiste en someter el tejido a la acción de proteasas y detergentes).

Tejidos Fijados en Formol e Incluidos en Parafina

• Este tipo de tejido es muy útil para la realización de estudios retrospectivos (de periodos anteriores).
• La calidad de los ácidos nucleicos obtenidos a partir de este tipo de tejidos puede ser peor que la de aquellos obtenidos a partir de tejidos frescos (fragmentación del ADN, degradación parcial del ARN).
• El pretratamiento que requiere este tipo de tejidos es una desparafinación.

Cultivos de Bacterias y Levaduras

Un cultivo es la forma en la que se hacen crecer los microorganismos (colonias) en una superficie sólida (agar) o en medio líquido (caldo) e incluso en células (línea celular) y es utilizado como el método principal para poder estudiar a los agentes causales de enfermedades, y saber si se trata de bacterias, hongos, virus, levaduras, parásitos o algas.

Células de la Mucosa Oral

Existen diversos sistemas para obtener células de la mucosa oral:

• Mediante raspado de la mucosa con torunda y cepillo. La muestra se puede sumergir en una solución conservante para que las células se desprendan.
• Mediante enjuague con una solución conservante.
• Recolectando directamente saliva.

Esputo

• A partir de él se pueden detectar o confirmar la presencia de cierto tipo de microorganismos patógenos causantes de infecciones respiratorias.
• El pretratamiento de la muestra consiste en la fluidificación con un agente mucolítico (N-acetil-cisteina) en una disolución de citrato sódico.

Extracción de Ácidos Nucleicos

Consiste en la obtención de un lisado celular de aspecto homogéneo en el que los ácidos nucleicos se encuentran libres de las estructuras celulares en las que se mantienen aislados. Dos procesos:

• La lisis celular, para liberar los ácidos nucleicos.
• La inactivación de las nucleasas celulares (ADN asas, ARN asas), para evitar la degradación de los ácidos nucleicos.

Extracción de ADN

Inicialmente es necesario llevar a cabo una lisis para liberar el ADN del interior celular, para ello se utilizan los buffers de extracción que contienen:

• Detergentes = Eliminan las membranas.
• Una molécula quelante = (EDTA), desestabiliza la membrana celular e inhibe a las DNA asas.
• Sales = (ClNa), que forma una capa iónica que recubre el ADN protegiéndola de la degradación.
• Buffer = (Tris-HCl), con un pH entre 7,5 y 8,2 para mantener el pH de la solución estable.
• Proteinasa K = Para degradar enzimas y proteínas.

Durante este proceso de extracción es común someter a la muestra a ciclos de incubación, a temperaturas entre los 50 y 70 ºC, alternados con agitación de la muestra (manual, vortex).

La temperatura de incubación no suele ser superior a 80ºC, ya que a esa temperatura se comienza a degradar el ADN.

Estas incubaciones facilitan la ruptura de los lípidos en la membrana celular, permitiendo la liberación del ADN de la estructura celular.

Purificación de ADN

• La purificación con solventes orgánicos: Este método se basa en las distintas solubilidades de los distintos componentes del lisado celular en solventes orgánicos, tales como fenol, cloroformo, alcohol isoamílico.
• La precipitación con sales (salting-out): Este método se basa en la precipitación de proteínas en presencia de altas concentraciones salinas. Estas altas concentraciones salinas disminuyen la solubilidad de las proteínas en medio acuoso, lo que va a provocar la precipitación de las mismas.
• La cromatografía de intercambio iónico: Se basa en la unión electroestática reversible de iones en solución a grupos funcionales cargados, los cuales están unidos covalentemente a una fase estacionaria.
• La cromatografía de adsorción: Se basa en la capacidad de adsorción del ADN a membranas de vidrio o sílice, empaquetadas en columnas de isopropileno, en presencia de sales caotrópicas.
• La purificación mediante esferas magnéticas: Se basa en la unión del ADN a microesferas magnéticas, las cuales pueden ser retenidas mediante un imán.
• La ultrafiltración: Se basa en la retención por el tamaño de las moléculas de ADN. Esto se hace mediante membranas con un tamaño de poro determinado.

Extracción y Purificación de ARN

• Trabajar con guantes en cabinas de flujo laminar.
• Limpieza con soluciones inactivadoras de ARN asas.
• Todo el material que se use debe estar certificado como libre de ARN asas (tubos, eppendorf, puntas de micropipeta).
• Todos los reactivos empleados en el proceso y el agua destilada también deben estar libres de ARN asas.
• La solución de lisis debe contener un agente caotrópico que inactive ARN asas.

Electroforesis

• Este proceso sirve para separar moléculas de ácidos nucleicos (ADN) de distintos tamaños.
• Permite analizar los productos obtenidos después de una extracción y purificación de ácidos nucleicos (ADN) y los productos amplificados obtenidos tras realizar una técnica de PCR.
• La electroforesis de ADN es útil para comparar muestras de individuos sanos frente a individuos enfermos, para la identificación de ácidos nucleicos de agentes infecciosos, y para la obtención de un fragmento determinado de ADN el cual puede ser utilizado para análisis posteriores.

Procedimiento

1. Se mezclan la agarosa, el buffer y el agua destilada.
2. Se calienta la disolución en el microondas, durante aproximadamente un minuto, hasta que desaparece la turbidez de la misma.
3. Se añaden X µl de Red Safe.
4. Se deja enfriar (vigilando que no solidifique).
5. Finalmente se vierte sobre los moldes, se colocan los peines necesarios y se deja solidificar el gel.

Almacenamiento de los Ácidos Nucleicos

Para reducir o evitar la degradación de los ácidos nucleicos:

• Se deben usar tubos eppendorf o criotubos herméticos y libres de nucleasas (ADN asas, ARN asas).
• Este tipo de muestras se almacenan en frío de forma habitual: Las muestras de ADN, si se van a utilizar en 4-5 días se pueden almacenar en nevera a 4 ºC. Para tiempos de utilización mayores se requiere almacenar este tipo de muestras a –20 ºC y preferiblemente a -80 ºC. Las muestras de ARN, se tienen que almacenar siempre a -20 ºC para tiempos cortos y -80 ºC para tiempos largos.
• Conviene que los congeladores utilizados para el almacenamiento de este tipo de muestras estén dotados de numerosos sistemas de alarma (sistema de monitorización de temperatura, sistemas de alerta…
• La trazabilidad de la muestra debe ser clara y permanente.