B1. Tinción Gram+ o Gram- y por qué:

Tinción de Gram (Christian Gram):

La tinción de Gram es una tinción diferencial que permite clasificar las bacterias en dos grandes grupos: Gram+ y Gram-. El procedimiento implica los siguientes pasos:

1. Colorante básico (cristal violeta): Tiñe todas las células de color azul/violeta.
2. Solución yodada (mordiente): Fija el cristal violeta a la pared celular.
3. Decoloración (alcohol): Las Gram+ retienen el colorante, mientras que las Gram- se decoloran.
4. Tinción de contraste (safranina): Tiñe las Gram- de rosa o rojo.

La diferencia en la coloración se debe a la distinta estructura de la pared celular bacteriana. En las Gram+, el peptidoglicano representa hasta el 90% y contiene ácidos que contribuyen a la carga negativa de la pared. En las Gram-, el peptidoglicano representa solo el 5-10%.

B1. Resolución de una muestra de levaduras/bacterias lácticas y cómo mejorarla:

La resolución es la capacidad de una lente para separar o distinguir dos puntos adyacentes. Depende de la longitud de onda (λ) y de la apertura numérica (AN = n sen θ), donde θ es el ángulo de la luz que entra al objetivo y n es el índice de refracción del medio. La ecuación de Abbé define la distancia mínima (d) entre dos objetos resolubles: d = 0.5λ / AN.

Para mejorar la resolución, se puede utilizar la técnica del aceite de inmersión. Este aceite transparente, con un alto índice de refracción, aumenta la apertura numérica de la lente del objetivo, mejorando así la resolución.

B1. Postulados de Koch:

Robert Koch, quien estudió el carbunco (Bacillus anthracis), formuló los siguientes postulados para demostrar que un microorganismo específico causa una enfermedad determinada:

1. El microorganismo patógeno sospechoso debe estar presente en todos los casos de la enfermedad y ausente en animales sanos.
2. El microorganismo sospechoso debe cultivarse en cultivo puro.
3. Las células de un cultivo puro del microorganismo aislado deben causar la enfermedad en animales sanos.
4. El microorganismo debe ser reaislado del animal inoculado y ser idéntico al original.

B1+B2. ¿Qué es un medio de cultivo puro y por qué lo utilizó Koch?:

Un cultivo puro contiene un solo tipo de microorganismo, a partir de colonias aisladas que deben ser bioquímica y fisiológicamente iguales. Su importancia radica en aislar e identificar microorganismos. En microbiología enológica, ayudan a la identificación y seguimiento, selección de microorganismos y estudio de su comportamiento enológico.

Koch utilizó cultivos puros porque su hipótesis era que un microorganismo específico causa una enfermedad específica. Para demostrarlo, debía aislar el microorganismo en un cultivo puro e inocularlo en animales sanos. Si los animales desarrollaban la misma enfermedad y se aislaba el mismo microorganismo, se cumplían sus postulados.

B2. Definición de medio y ventajas de medios sólidos/líquidos:

Un medio de cultivo es una preparación líquida, semisólida o sólida que contiene los nutrientes necesarios y mantiene las condiciones adecuadas para el desarrollo de microorganismos. La diferencia entre los medios sólidos y líquidos radica en la presencia de agar (10-30 g/L en sólidos). Los medios sólidos permiten aislar colonias y facilitar su estudio, mientras que los medios líquidos son útiles para aislar microorganismos presentes en baja concentración.

B2. Clasificación de medios de cultivo:

Estado físico:

• Líquidos: sin agar.
• Semisólidos: <10 g/L de agar.
• Sólidos: 10-30 g/L de agar.

Composición química:

• Natural: a partir de sustancias naturales (composición química desconocida).
• Definido o sintético: composición química conocida.
• Complejo: componentes de composición química definida que satisfacen las necesidades de varios microorganismos.

Funcionalidad:

• General: para cultivar diversos microorganismos, con elementos básicos (macro y micronutrientes).
• Enriquecido: con componentes que facilitan el crecimiento de microorganismos exigentes.
• Selectivo: favorecen el crecimiento de determinados microorganismos mediante inhibidores.
• Diferencial: identifican una especie de microorganismo mediante colorantes.

B2. Problema 2: Recuento en cámara de Neubauer

Enunciado: El recuento de microorganismos presentes en una muestra se determinó mediante dilución de la muestra 1/100 y posterior recuento en cámara de Neubauer. Media de las esquinas: 7.5 células. ¿Cuál es la población de microorganismos en la muestra?

Volumen de la cámara = 0.1mm x 1mm x 1mm = 0.1mm³ = 10⁻⁴cm³ = 10⁻⁴ml

Células/ml = 7.5 x 10⁴ cel/ml (en la muestra 1/100)

Población total = 7.5 x 10⁶ cel/ml

Las cámaras de recuento tienen limitaciones: no distinguen viabilidad, dificultad con células pequeñas, precisión difícil y no son adecuadas con baja densidad celular.

B2. Problema 3: Recuento en placa

Enunciado: Seguimiento de la población de levaduras durante la fermentación alcohólica mediante recuento en placa. Diluciones decimales seriadas y siembra en masa de 1 ml. En un momento de la fermentación se obtuvieron 81 colonias en la placa 10⁻⁶. ¿Cuál sería la población?

Población = 81 UFC x 10⁶ = 8.1 x 10⁷ UFC/ml

B2. Metabolismo: fermentación alcohólica

El metabolismo es el conjunto de reacciones químicas en la célula. El catabolismo degrada moléculas complejas, liberando energía (ATP). El anabolismo sintetiza moléculas complejas, requiriendo energía (ATP). La fermentación alcohólica es un proceso catabólico donde el aceptor de electrones es un intermediario de la vía. Los microorganismos usan la vía de Embden-Meyerhoff para catabolizar la glucosa. En la fermentación alcohólica, el NADH se oxida a NAD+, el piruvato o un derivado actúa como aceptor de electrones, y la fosforilación oxidativa no funciona, disminuyendo el rendimiento de ATP. C₆H₁₂O₆ → 2CO₂ + 2C₂H₅OH + 2ATP

B2. Recuento de poblaciones (directa e indirecta):

Medidas directas:

• Recuento directo:
  • Microscopio con cámara de recuento: limitaciones: no distingue viabilidad, dificultad con células pequeñas, precisión difícil, no adecuado con densidad celular baja.
  • Citómetro de flujo: muy preciso pero costoso.
• Filtración en membrana: para muestras con baja densidad microbiana. Resultados en UFC/unidad de volumen filtrado.
• Siembra en placa (recuento de viables): para células capaces de dividirse. Resultados en UFC/ml. Limitaciones: adecuación del medio, condiciones de incubación, colonias pequeñas o mezcladas, tamaño de colonias, errores de preparación.

Medidas indirectas:

• Medida de la masa celular:
  • Peso seco: poco sensible, errores al recoger células.
  • Turbidez: estimación del número de células mediante densidad óptica. Limitaciones: no distingue viabilidad, pierde linealidad a altas concentraciones.

B2. Glucólisis (vía Embden-Meyerhoff) en Saccharomyces:

La vía Embden-Meyerhoff es la más común para degradar glucosa y otros azúcares. Funciona en respiración aerobia, anaerobia y fermentación. Es una vía anfibólica, que ocurre en la matriz citoplasmática.

Otras vías de degradación de azúcares son la vía de las pentosas fosfato y la vía Entner-Doudoroff (en algunas bacterias del suelo).

B3. PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa):

La PCR amplifica un fragmento de DNA o RNA a partir de una pequeña cantidad de material genético. Se basa en la replicación del DNA por la ADN polimerasa, usando ciclos de temperatura para separar y unir las hebras de DNA.

B3. Transformación, transducción y conjugación:

Son mecanismos de transferencia horizontal de genes entre bacterias:

• Transformación: DNA donador libre.
• Transducción: transferencia mediada por virus.
• Conjugación: contacto célula-célula.

B3. Productos de replicación, transcripción y traducción:

Replicación: dos moléculas de DNA idénticas a la original (semiconservativa).

Transcripción: RNA (generalmente ARNm).

Traducción: Proteínas.

B3. Ribosomas: estructura y función:

Los ribosomas, formados por proteínas y ARN ribosomal (ARNr), sintetizan proteínas a partir del ARNm (traducción). El ARN de transferencia (ARNt) lleva los aminoácidos al ribosoma.

B3. Relación PCR-RFLP:

RFLP (Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos de Restricción) usa enzimas de restricción (endonucleasas) que cortan el DNA en secuencias específicas. La técnica PCR-RFLP amplifica fragmentos de DNA por PCR y luego los corta con enzimas de restricción. Las diferencias en las secuencias de DNA generan fragmentos de distinto tamaño, visibles por electroforesis.

B1. Dibujo de una levadura y sus partes:

→ n = 20

b) → → g = 0.5 h

c) El mejor momento para medir k y g es durante la fase exponencial del crecimiento, donde la velocidad es máxima y el crecimiento es equilibrado.

B3. Efecto de la temperatura en el DNA:

B1. Experimento de Pasteur contra la generación espontánea:

Pasteur demostró que la fermentación alcohólica es catalizada por levaduras y refutó la teoría de la generación espontánea.

B3. Experimento de Griffith (Streptococcus pneumoniae):

B3. Efecto de la mutación TAC (tirosina) a TAG en una proteína:

Deleciones/Inserciones:

Recombinación genética: intercambio físico de material genético entre dos genomas diferentes (general u homóloga).