Bases Moleculares de la Información Biológica

La sustancia responsable de mantener, expresar y transmitir la información biológica tiene que cumplir los siguientes requisitos:

• Almacenamiento de la información: La sustancia es un almacén de la información genética que puede ser expresada o no.
• Versatilidad: Tiene que ser capaz de codificar la infinita variedad de productos génicos que se encuentran en todas las formas de vida existentes.
• Estabilidad: No debe variar con demasiada rapidez esta información para el mantenimiento de las diferentes formas de vida.
• Transmisión: La replicación (duplicación de la sustancia) que sucede en la célula para transmitir las mismas características a las células hijas.
• Expresión de la información genética: Almacenada implica al dogma central de la biología.

El ADN es un compuesto orgánico macromolecular que está estructurado por ácidos nucleicos que almacena y transmite la información biológica. El conocimiento de sus componentes químicos, los nucleótidos, es esencial para entender su estructura y función. Los ácidos nucleicos son grandes polímeros compuestos por monómeros que son los nucleótidos.

Estructura Primaria del ADN

Para formar los polímeros de ácidos nucleicos, los nucleótidos se unen mediante enlaces fosfodiéster. Cadena polarizada por convenio se establece la dirección 5’-3’. El orden exacto de los nucleótidos es fundamental para la información genética que contiene el ADN. Púricas = Pirimidínicas.

Difracción de rayos X producido por la fibra de ADN (Franklin y Wilkins). Bombardeo de RX sobre la fibra, los rayos se dispersan (difractan) en un patrón dependiente de la estructura atómica y es captado en una película fotográfica. Hay una periodicidad de 3,4 Amstrom (sugiere apilamiento de bases unas sobre otras como monedas), además Rosalind Franklin sugirió que la estructura podría ser de una doble hélice pero no describió nada definitivo. Los arcos oscuros de la periferia son los que permitieron averiguar la periodicidad de las bases nitrogenadas y que están realmente apiladas. El patrón de manchas cruciforme indicaba la naturaleza de doble hélice helicoidal. Las bases apiladas están separadas unas de otras por 3,4 Amstrom (0,34 nm). Cada vuelta de hélice tiene una longitud de 34 Amstrom (3,4 nm) – tiene una longitud equivalente a 10 pares de bases. La doble hélice mide de diámetro 20 Amtrom (2 nm).

Propiedades Físico-Químicas de los Ácidos Nucleicos

Absorbancia a 260 nm

El estado físico de los ácidos nucleicos está relacionado con su capacidad de absorción de la luz ultravioleta (UV) a 260 nm. El menor grado de absorción se produce en estado de doble hélice, la absorción aumenta cuando se produce la desnaturalización pasando a estado de hélice sencilla. Si además, degradamos este ADN de hélice sencilla a nivel de nucleótidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia. Son las bases púricas y pirimidínicas las que tienen la capacidad de absorber la luz UV a esa longitud de onda. Así, podemos averiguar el estado de desnaturalización del ADN (apreciamos la integridad del ADN según la absorbancia a 260 nm) observando el incremento de absorción a esta longitud de onda. El ADN desnaturalizado absorbe un 37% más de luz a 260 nm que en su forma helicoidal y apareada.

Densidad de Flotación

Cuando se centrifuga a alta velocidad una solución densa (saturada) de un soluto de bajo PM como es el ClCs se produce un equilibrio entre dos fuerzas opuestas, la de difusión ascendente del soluto y la fuerza de sedimentación, como consecuencia se produce un gradiente de densidad que aumenta en la dirección de la fuerza centrífuga (aumenta a medida que avanzamos hacia el fondo del tubo de centrífuga). Si añadimos una molécula de ADN, ésta migrará hacia el fondo del tubo hasta llegar al punto en que la densidad del soluto (ClCs) coincide con la densidad del ADN centrifugado (densidad de flotación). Posteriormente, es posible aislar las moléculas de ADN de diferente densidad practicando un orificio en el fondo del tubo y sacando varias fracciones diferentes. Separación de una mezcla de ácidos nucleicos mediante centrifugación en gradiente de ClCs.

Centrifugación en cloruro de cesio: Basándose en múltiples estudios de la densidad de los ADNs de diferentes organismos y de su composición en bases nitrogenadas, se ha establecido una fórmula empírica que relaciona la densidad del ClCs y por tanto la densidad de flotación del ADN (ρ) con su contenido en G+C expresado en moles por ciento. Está fórmula es la siguiente ρ = 1,660 + 0,00098(G+C).

• A menor densidad (hacia la superficie del tubo de centrífuga) el contenido en G+C es menor.
• A mayor densidad (hacia el fondo del tubo de centrífuga) contenido en G+C mayor.

Hibridación de Ácidos Nucleicos

Para localizar las secuencias de interés, la sonda debe hibridar con la secuencia de ADN de la muestra. El primer paso consiste en desnaturalizar las moléculas de ADN (separar las hebras complementarias de la estructura en doble hélice del ADN), tanto la de la sonda como la de la muestra de estudio. Para ello elevamos la temperatura hasta 90 – 95 ºC y de este modo se rompen los puentes de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas del ADN (podemos fomentarlo añadiendo una solución de alto pH que rompe los puentes de hidrógeno entre las dos hebras de ADN). Después se hibrida la sonda con su región complementaria del ADN de la muestra, se incuban a menor temperatura la sonda de interés con la muestra, y por complementariedad de las bases se une la sonda de interés con la región complementaria del ADN de la muestra.

Protocolo de Extracción de ADN (Virtual Labs – DNA Extraction)

Lisis Celular

Durante la lisis celular se procede a la destrucción de las estructuras lipídicas y proteínas para liberar los ácidos nucleicos que se encuentran en el núcleo celular de las células eucarióticas. Se suelen emplear soluciones salinas que pueden contener detergentes.

Purificación de Ácidos Nucleicos

Extracción con solventes orgánicos: el lisado celular se mezcla con fenol, cloroformo para separar las proteínas de los ácidos nucleicos y finalmente se precipita con alcohol isoamílico. Después y una vez eliminado el alcohol, el ADN precipitado se resuspende en agua.

• Cromatografía de intercambio iónico.
• Adsorción a una columna de sílice (polvo de diatomeas).

Purificación con Columna de Cromatografía de Intercambio Iónico

Purificación de ADN mediante la utilización de columnas o soportes con carga que retienen los ácidos nucleicos. Tras la realización de la lisis alcalina, el ADN se une a través de grupos fosfato (negativos). Se lava el exceso de restos celulares y proteínas y posteriormente se rompen las fuerzas electrostáticas del soporte y los ácidos nucleícos pasando una solución de alto pH. Soporte de sílice con metil amino etanol. La unión del ADN se debe principalmente al grupo fosfato.

Purificación con Columna de Sílice: Cromatografía de Adsorción

Tras la realización de la lisis alcalina, el ADN generalmente está hidratado y rodeado de moléculas de agua. Añadimos una sal caotrópica (que deshidrata el ADN). El sodio de la sal caotrópica tiene un papel enlazante entre el oxígeno y el ADN cargado negativamente. Lavamos sucesivamente la columna para quitar restos de proteínas y celulares con disolventes no acuosos y finalmente eluimos el ADN añadiendo agua.

Electroforesis en Gel de Agarosa

Tampón TAE de carrera y del gel: Es el medio usado para preparar el gel y desarrollar la electroforesis. Recibe este nombre de las iniciales de sus componentes. El pH es 7,5, para que todos los grupos fosfato del ADN estén ionizados por completo y éste se mantenga cargado negativamente. La composición habitual es Tris 40 mM, ác. acético 19 mM, EDTA 1 Mm. Permite mantener las moléculas de ADN con una carga negativa uniforme y constante. Es, por ello, componente del gel y del tampón de electroforesis, o tampón de cubeta.

TRIS: Las soluciones buffer o amortiguadoras resisten los cambios de pH ya que contienen ácidos-base débiles conjugados que neutralizan los iones H+ y OH-. Las soluciones amortiguadoras consisten de ácidos o bases débiles y las sales de esos ácidos o bases. En las electroforesis es el agente tamponante que mantiene el pH estable a 7,5.

EDTA: Acrónimo de EthyleneDiamine TetraAcetic acid, ácido etilendiamino tetraacético. En sus formas desprotonadas ( 2− y 4−), es un conocido agente quelante de cationes divalentes, en especial Ca2+ y Mg2+ . Dado que el Mg2+ es un cofactor requerido por la mayoría de nucleasas, su secuestro por el EDTA evita la degradación del ADN durante la preparación y la electroforesis.

Tampón de carga para cargar las muestras AZUL DE BROMOFENOL: Se trata de un compuesto coloreado y con carga, utilizado para comprobar el progreso de la electroforesis. En la electroforesis se mueve aproximadamente como las moléculas de ADN de 9000 pb. Puesto que su color azul es bien visible, permite detener la electroforesis con la confianza de que las moléculas grandes de ADN no se hayan salido del gel.

COMPONENTE QUE CONFIERE DENSIDAD AL ADN. Puede ser Ficoll, glicerol, sacarosa, son compuestos químicos que mezclados con el ADN lo hacen mucho más denso. Sirve para que al cargar las muestras en los pocillos el ADN no flote y corra.

La Replicación es Semiconservativa

La propiedad más notable de las células vivas es su capacidad de reproducirse con una fidelidad casi perfecta, no solamente una generación, sino durante centenares y millares de generaciones. El modelo que explica cómo se duplica el ADN se denomina modelo semiconservativo ya que a partir de una molécula de ADN obtendremos dos exactamente iguales, cada una con una hebra antigua (cadena oscura) y otra nueva (cadena roja): la cadena original comienza a separarse de un extremo a otro de modo que cada una de las hélices va a sintetizar una hélice nueva complementaria habiendo tomado como modelo o patrón a la hélice inicial.

La cantidad de ADN que se puede sintetizar a partir de un único origen de replicación se denomina unidad funcional de replicación. El genoma bacteriano es un replicón único circular. En los eucariotas la replicación del ADN se inicia en múltiples orígenes a la vez (hay uno cada 20 Kb aprox.).

Enzimas que intervienen en la replicación

• La helicasa rompe los puentes de hidrógeno de la doble hélice permitiendo el avance de la horquilla de replicación.
• La topoisomerasa impide que el ADN se enrede debido al super-enrollamiento producido por la separación de la doble hélice. Actúa sobre la topología del ADN desenrollándolo mediante roturas selectivas entre las dos hebras.
• Las proteínas SSB se unen a la hebra sencilla de ADN, impidiendo que la hebra se enrolle sobre sí misma y que forme estructuras secundarias que no permitan el avance de la replicación.
• La ADN polimerasa sintetiza la cadena complementaria de forma continua en la hebra adelantada y de forma discontinua en la hebra rezagada siempre que haya un extremo 3’ OH libre (dirección 5’-3’).
• La ARN primasa sintetiza el cebador de ARN necesario para la síntesis de la cadena complementaria a la cadena rezagada (fragmentos de Okazaki).
• La ADN ligasa une los fragmentos de Okazaki.

ADN Polimerasa: Mecanismo de Reacción

• Dirección de la síntesis: 5’—3’
• Requerimientos de la reacción de síntesis de ADN:
  • Cebador o iniciador: Oligonucleótido RNA 3’-OH libre (la replicación no es autoiniciadora).
  • Sustratos: dATP, dTTP, dGTP, dCTP.
  • Cofactores: Mg2+.
  • Molde o plantilla: complementariedad de bases.

A medida que la helicasa va rompiendo los puentes de hidrógeno la primasa va añadiendo un cebador en la cadena retrasada para que se genere un extremo 3’ OH.

Tener actividad exonucleasa 3’-5’ significa que tienen el potencial de polimerizar en una dirección (5’-3’), pararse, invertir su dirección y escindir los nucleótidos que acaban de añadir. Esta actividad proporciona capacidad de corrección de errores del ADN recién sintetizado eliminando y reemplazando los nucleótidos incorrectos. La actividad exonucleasa en 5’-3’ de la la DNA polimerasa uno proporciona la capacidad para eliminar los primers de RNA que inician la polimerización.

La Replicación es Semidiscontinua

En la hebra rezagada, cuando la DNA pol III hace contacto con el extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo, el cebador de RNA es eliminado y los dos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado son unidos. La eliminación de cebadores también se da en la hebra conductora, de síntesis continua, pero debido a que en ésta hay un solo cebador es un proceso que sólo tiene lugar una vez, mientras que en la hebra rezagada se dará tantas veces como fragmentos de Okazaki haya.

¿Cómo ocurre?

En la eliminación del cebador intervienen dos enzimas:

• Por un lado la DNA pol I que va eliminando el ARN con su actividad exonucleasa 5′ → 3′ y simultáneamente rellenando con ADN mediante su actividad polimerasa 5’→ 3′ (proceso denominado nick translation). Al final queda rotura (o «mella») entre el extremo 3′-OH libre y el fosfato 5′ de la cadena sintetizada que es sellado por
• la DNA ligasa; catalizando la reacción de condensación entre el grupo fosfato y el OH de la desoxirribosa del nucleótido contiguo, completando el enlace fosfodiéster y es necesario hidrolizar una molécula de ATP.

Amplificación de las Secuencias Mediante la Técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction)

Reacción en cadena de la Polimerasa. NOS PERMITE SINTETIZAR MILLONES DE COPIAS DE UN FRAGMENTO DE ADN.

Optimización de la Reacción de Amplificación

• Temperaturas y tiempos de los ciclos
  • Desnaturalización: es necesario que el ADN se desnaturalice totalmente. Para ello se recomiendan temperaturas de 94ºC durante 30’’-1’. Si la muestra tiene alto contenido en G y C se puede aumentar el tiempo o la Tª (Sin embargo, hay que tener en cuenta que la polimerasa se degrada y su actividad decrece).
  • Anillamiento o hibridación: la Tª y tiempo dependen de dos factores relacionados con los cebadores: la composición de bases y el tamaño. Tm=4(G+C)+2(A+T). En la práctica la Tª de hibridación puede oscilar entre 45-65ºC durante un tiempo comprendido entre 30’’ y 1’. Un aumento de la Tª favorece la especificidad de la reacción ya que disminuye la posibilidad de la existencia de uniones incorrectas. Se debe evitar que la Tª pueda ser muy parecida a la de extensión o elongación.
  • Síntesis o elongación: la etapa de extensión o polimerización propiamente dicha se suele realizar a 72ºC. El tiempo de extensión dependen del tamaño de la amplificación (cuanto más grande es el fragmento a amplificar el tiempo ha de ser mayor). Se puede estimar el tiempo de 1 min. para amplificar 1 Kb. En la práctica es también normal que al final de todos los ciclos de la reacción, se añada un paso de elongación final de 7 minutos a 72ºC.
• Nº de ciclos: Depende de la cantidad de ADN que queremos amplificar existente en la muestra de partida. Es importante no realizar un nº alto de ciclos ya que puede dar lugar a la amplificación de productos no deseados (hibridaciones no específicas) Y hay que tener en cuenta que la enzima se va inactivando conforme transcurre el nº de ciclos.

Componentes de una Reacción de PCR

• ADN a amplificar (diana):
  • El ADN no puede estar fragmentado.
  • La muestra no debe llevar agentes quelantes (EDTA) que reducen la concentración del ion divalente Mg2+ (cofactor de la polimerasa) en la disolución.
  • Tampoco debe haber presencia de reactivos como fenol o detergentes o de determinados factores sanguíneos que inhiben la actividad de la polimerasa.
• Primers o cebadores (18-25 nts):
  • No seleccionar cebadores que en su extremo 3’ tenga una estructura secundaria.
  • Es recomendable que las bases del extremo 3’ sean G o C (porque establecen 3 puentes de H, unión más estable que la que establecen las bases A o T).
  • Se debe evitar complementariedad entre pareja de cebadores.
  • Tamaño de cebadores entre 18-30 pb. La Tª de hibridación debe similar entre ambos Tm=4 (G+C)+2(A+T) Siendo G, C, A y T el nº de cada una de las bases que integran cada cebador. La Tª de hibridación debe ser aprox. 2ºC menor que la calculada. Deben poseer un contenido en G+ C de aproximadamente 50%.
• dNTPs
• ADN polimerasa termoestable: (suele ser la denominada taq – de Thermus aquaticus- polimerasa)
• Cl2Mg (cofactor de la polimerasa): Se añade a la reacción Cl2Mg: altas concentraciones de Mg2+ disminuyen la especificidad de la reacción. Bajas concentraciones de Mg2+ aumentan la especificidad de la reacción.
• Tampón

Limitaciones de la PCR

• Es necesario el conocimiento previo, de al menos una parte de la secuencia del ADN diana para permitir la construcción de los cebadores.
• Su gran capacidad de amplificar cantidades de ADN sumamente pequeñas determina que la contaminación sea un problema importante (importancia de los controles).
• Exactitud de las polimerasas (la Taq polimerasa estándar incorpora un nucleótido incorrecto aproximadamente cada 20.000pb): actualmente ya existen polimerasas termoestables que no cometen tantos errores y presentan mayor capacidad de corrección (se llaman de alta fidelidad).
• Tamaño de los fragmentos: actualmente existen polimerasas que amplifican fragmentos más grandes (algunas hasta 10 Kb).
• Los fragmentos de PCR obtenidos tras la amplificación utilizando la Taq DNA polimerasa que añade preferencialmente adeninas en el extreme 3’ son difíciles de clonar en vectores. Para este fin se han diseñado plásmidos que presentan en sus extremos 5’ timinas.
• Vector-T: Plásmido con extremos 5’-T de cadena sencilla. Permite clonar productos de PCR que contienen A de cadena simple en los extremo-3’, sin previa digestión del vector con enzimas de restricción (ER).

Método Enzimático. Método de Sanger

Es un método de terminación de la cadena: Se emplean unos nucleótidos modificados de manera que su incorporación en la hebra que se está sintetizando impide que el ADN siga elongándose: son los dideoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs).

Componentes Necesarios

1. ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar (clonado en un vector).
2. ADN Polimerasa
3. Primers de alrededor de 20 nucleótidos de longitud necesarios para proveer a la polimerasa del extremo 3’OH. Estos primers deberían poseer una secuencia de bases complementaria a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Como desconocemos la secuencia se emplean unos primers con secuencia complementaria al vector donde tenemos clonado el ADN que queremos secuenciar. Los «primers» utilizados suelen marcarse radiactivamente.
4. Nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y nucleótidos dideoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucleótidos dideoxi son nucleótidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posición 3′ de la desoxirribosa. Estos nucleótidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningún otro nucleótido por el extremo 3′. Por tanto, una vez incorporado un nucleótido dideoxi se termina la síntesis de esa cadena de ADN.

• Radiactividad: Incorporación de nucleótido marcado con un isótopo radiactivo
• Fluorescencia: Marcaje fluorescente. Incorporación de fluorocromos.
• Digoxigenina: Marcaje mediante incorporación de un nucleótido marcado con digoxigenina que reacciona con un anticuerpo secundario antidigoxigenina que emite luminiscencia, color…

Marcaje de ADN: Se lleva a cabo con las enzimas:

• Fosforilación terminal: 5’ POLINUCLEÓTIDO QUINASA (es una fosfo-transferasa que cataliza la incorporación de un grupo fosfato proveniente del ATP a los extremos 5’ del ADN o ARN que se encuentran previamente desfosforilados por la acción de una fosfatasa alcalina).
• Nick Translation: Mediante utilización de DNA polimerasa I: Digestión del ADN a partir del cual se quiere hacer una sonda: con una nucleasa (produce nicks, es decir se producen roturas en el ADN) que serán rellenados, por la DNA polimerasa I que añadirá nucleótidos a partir de nucleótidos marcados y como en este caso tiene actividad: polimerasa y exonucleasa 5’-3’ irá degradando los nucleótidos que serán sustituidos por nucleótidos marcados.
• Random primer mediante la utilización del Fragmento Klenow de la DNA polimerasa método con primers (hexámeros diseñados al azar) Estos primers de pequeño tamaño anillan al azar en el fragmento de ADN que queremos marcar. Se utiliza uno de los dNTPs marcados.
• Random primer: Método basado en la creación de un extremo 3’OH mediante la utilización de primers o cebadores inespecíficos que anillan al azar y que permiten la creación de varios extremos 3’OH libres para que pueda intervenir la DNA polimerasa I actuar añadiendo nucleótidos a partir de dNTPs marcados (con radiactividad, digoxigenina, fluorocromo…). El fragmento proteico de esta Polimerasa el denominado fragmento de Klenow es un fragmento proteico de gran tamaño perteneciente a la DNA Pol I de E. coli. Este fragmento puede separarse del resto de la enzima gracias a la proteasa subtilisina y mantiene la actividad polimerasa 5’ → 3’ y la actividad exonucleasa 3’ → 5’ (corrección de errores y hacia atrás) pero pierde su actividad exonucleasa 5′ → 3‘ (quita cebadores).
• PCR mediante la utilización de Taq polimerasa: Utilización de Primers de secuencia conocida. Se lleva a cabo PCR con uno de los dNTPs marcados.

Estas sondas las generamos para usarlas en experimentos de hibridación de ácidos nucleicos: Southern blot (HIBRIDACIÓN DNA-DNA) Northern blot (HIBRIDACIÓN DNA-RNA).

Fundamento: Hibridación de Ácidos Nucleicos: Solución, Filtro de nitrocelulosa, Preparación de cromosomas, Corte de tejidos, Genotecas… TODAS ESTAS TÉCNICAS SE BASAN EN LA CAPACIDAD DE DESNATURALIZACIÓN Y RENATURALIZACIÓN QUE POSEE EL ADN.

Aplicación: Southern Blot

Transferencia de ADN: Southern: El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante una electroforesis en un gel. Los fragmentos de ADN de doble cadena son parcialmente hidrolizados con un ácido débil y desnaturalizados químicamente con NaOH. Posteriormente, el ADN es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. La hibridación con una sonda marcada nos permite detectar esa secuencia específica en nuestro ADN genómico separado en el gel.

Transferencia de ARN: Northern Blot

Es una técnica para transferir fragmentos de ARN desnaturalizados provenientes de un gel a un medio sólido. El ARN es separado en un gel de agarosa desnaturalizante y posteriormente transferido a una membrana de nylon. Después de la transferencia de estos fragmentos de ARN a la membrana, se añade una sonda.

Cuando corremos un gel de ARN no se pueden observar los mRNAs, son muy minoritarios.

Gel de ARN eucariótico Se observa solo el RNAr que va a formar parte de las subunidades ribosomales: 28s, 18s, 5,8s.

Estas técnicas basadas en la hibridación de ácidos nucleicos nos permitirán analizar diferentes aspectos:

• Si queremos saber si un gen de especie está también en otra…
• Si la secuencia de dicho gen tiene en ambas especies la misma estructura, si está duplicado o es de copia única…
• Si un gen se expresa en todos los tejidos y/o órganos de una misma especie y si el nivel de expresión es diferente entre ellos…
• Si a lo largo del desarrollo la expresión cambia….

La Ingeniería Genética es un conjunto de técnicas, nacidas en la biología molecular que permiten manipular el genoma de un ser vivo. Estas técnicas permiten introducir genes nuevos de cualquier procedencia, eliminar genes, modificar genes…

OMGs: Origen gen distinta procedencia=TRANSGÉNICOS. Origen gen misma procedencia=CISGÉNICOS.

Unidad de Expresión: En muchos casos, se trata de conseguir construir unidades de expresión legibles por parte de las polimerasas de los organismos donde van a ser introducidas. Las construcciones (recortar y pegar) se llevan a cabo clonando en vectores y multiplicando la construcción en bacterias: Escherichia coli para posteriormente transferir el ADN deseado a los organismos de interés. El desarrollo de la ingeniería genética (también llamada metodología del ADN recombinante) fue posible gracias al descubrimiento de las enzimas de restricción y de los plásmidos (vectores).

Enzimas para la manipulación de ADN: enzimas de restricción y ADN ligasas (obtención de ADN recombinante).

Enzimas que modifican los extremos: fosfatasa y polinucleótido quinasa (obtención de sondas).

Transcriptasa inversa: análisis de la expresión génica (transcripción = Northern).

Las enzimas de restricción de tipo II reconocen determinadas secuencias en el ADN. De esta manera, conociendo la secuencia de un fragmento de ADN es posible aislarlo del genoma original para insertarlo en otra molécula de ADN. Hay muchas enzimas de restricción obtenidas a partir de bacterias y que sirven como herramientas para la ingeniería genética. Las secuencias que reconocen las enzimas de restricción de Tipo II son palindrómicas.

Las enzimas de restricción reconocen secuencias de 4, 6 o más bases y cortan generando extremos romos o extremos cohesivos. La frecuencia de reconocimiento y corte de la enzima de restricción en un fragmento de ADN viene determinada por la probabilidad:

• Una secuencia de 4 bases tiene la probabilidad de ocurrir en un genoma cada 256 pb
• Una secuencia de 6 bases tiene la probabilidad de ocurrir en un genoma cada 4096 pb
• Una secuencia de 8 bases tiene la probabilidad de ocurrir en un genoma aproximadamente cada 65000 pb.

Los fragmentos de ADN separados en un gel pueden ser recortados del mismo y purificados de tal manera que separamos el ADN de la agarosa. Así podremos clonar ese fragmento en un vector que haya sido digerido con la misma enzima de restricción que el fragmento (utilizando una ligasa).

DNA-LIGASAS: UNEN FRAGMENTOS DE DNA MEDIANTE ENLACE COVALENTE: FOSFODIESTER ENTRE NUCLEÓTIDOS ADYACENTES, sella los huecos entre azúcar-fosfato.

ADN ligasa reparando un cromosoma dañado. En la célula sirve:

• Para unir fragmentos de okazaki.
• Para eventos de senescencia.
• Para defensa frente a agentes patógenos…

Ligación del ADN

Para la obtención de ADN Recombinante

• Se mezclan los ADNs de distinta procedencia cortados por la misma enzima de restricción en un tubo de ensayo
• Las bases complementarias se unen formando puentes de hidrógeno (tres para GC y dos para AT)
• Y finalmente los extremos se sellan con DNA ligasa QUE FORMAN EL ENLACE FOSFODIESTER.

Se suele utilizar la ligasa del bacteriófago T4 que une tanto extremos romos como cohesivos.

Otras Enzimas de Interés

Enzimas modificantes de extremos (fosfatasas y polinucleótido quinasa)

• Fosfatasas (ver obtención de sondas de ADN) ELIMINAN EL FOSFATO DEL EXTREMO 5’ DEL DNA O RNA. APLICACIONES: Eliminar los grupos 5´-fosfato de fragmentos de DNA para posteriormente marcarlo con fosfato radiactivo mediante la polinucleótido quinasa.
• Quinasas (ver obtención de sondas de ADN) FOSFORILAN EXTREMOS LIBRES 5’ EN DNA O RNA. APLICACIONES: Marcaje de sondas. Marcaje de cebadores o primers en su extremo 5’.
• Transcriptasa Inversa La transcriptasa inversa, transcriptasa reversa o retro-transcriptasa es una enzima de tipo ADNpolimerasa, que tiene como función sintetizar ADN de doble cadena utilizando como molde ARN monocatenario, es decir, cataliza la retrotranscripción o trasncripción inversa. Esta enzima se encuentra presente en los retrovirus. Su nombre obedece a que el proceso normal de la transcripción, la que se puede llamar «directa», codifica el ARN a partir de la secuencia inicial de ADN, y no al revés. REALIZAN LA SÍNTESIS DE DNA A PARTIR DE UN MOLDE DE RNA, UN primer o cebador CON 3’OH LIBRE Y DESOXINUCLEÓTIDOS. APLICACIÓN: Análisis de la transcripción (al igual que el Northern). Cuantificación de la transcripción (expresión génica).

La PCR a Tiempo Real

Variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de amplificación ADN. Para ello emplea un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le añade una sustancia marcada con un fluoróforo que se une al DNA que se va generando. El termociclador cuenta con sensores para medir fluorescencia.

Clon: grupo de células que contienen la misma molécula de DNA recombinante. Conjunto de fragmentos idénticos de ácido desoxirribonucleico obtenidos a partir de una misma secuencia original.

Construcción de moléculas de DNA recombinante: Aislamiento de un fragmento de DNA – Identificar un carácter deseable en el organismo de origen. – Encontrar el gen responsable del carácter deseado (gen de interés). – Aislar el gen (mediante digestión con enzimas de restricción o mediante PCR). Unir el fragmento a un vector de clonación – Tipo de vector (elegir el vector) y digerirlo con enzima de restricción. también se pueden utilizar vectores especiales para clonar fragmentos de PCR) – Método de unión del gen al vector (utilización de ligasas). Introducir el vector recombinante dentro de las células del huésped (transformación con el nuevo ADN recombinante de las células receptoras). Identificación de las células que contienen: se tienen que identificar cuáles son las células que han adquirido ese nuevo ADN recombinante. Todo se realiza mediante la consecución de los siguientes procesos AISLAMIENTO DE ADN DE INTERÉS PREPARACIÓN DEL PLÁSMIDO O VECTOR DE CLONAJE. Ligación:El gen de interés se inserta en el plásmido-vector después de digestión con ER y tratamiento con la ligasa. Transformación:Introducir el vector recombinante dentro de las células del huésped. Selección:Identificación de las células que contienen la molécula de DNA recombinante.

Vectores de clonación y células huésped: Los plásmidos son moléculas de DNA circulares, originalmente aisladas de bacterias y que pueden extraerse de las mismas e incorporarse a otras, a través del proceso de transformación. Los plásmidos fueron modificados por los investigadores para ser empleados como “vectores”. Así, el gen de interés puede insertarse en el plásmidovector e incorporarse a una nueva célula.Los plásmidos son moléculas de ADN circulares, originalmente aisladas de bacterias y que pueden extraerse de las mismas e incorporarse a otras bacterias, a través del proceso de transformación. Los plásmidos fueron modificados por los investigadores para ser empleados como “vectores”. CARACTERÍSTICAS: ORIGEN DE REPLICACIÓN, MARCADORES SELECTIVOS, SITIOS DE RESTRICCIÓN ÚNICOS MCS (multiple cloning site ): región de clonación múltiple.

Transformación bacteriana: ¿Cómo se obtienen bacterias competentes? – Mediante choque térmico en presencia de Ca2+ El choque térmico produce poros en la membrana y el Ca2+ favorece que no se repela la membrana y el plásmido (ambos con cargas negativas)que contrarresta las cargas negativas del plásmido y de la pared celular para favorecer la entrada del plásmido a la bacteria al ser ésta tratada por calor dando lugar a la formación de poros. – Mediante electroporación. Cuando el voltaje que atraviesa una membrana plasmática excede su rigidez se forman poros.

DOS TIPOS DE GENES MARCADORES: – de selección. Las células que no los contienen se mueren – de información. Dan una nueva característica a las células que los contienen. Genes marcadores de selección. Permiten a la célula transformada vivir en presencia de un agente selectivo, que suele ser un antibiótico o un herbicida. Dicho agente, añadido al medio de cultivo, mata las células no transformadas. Un buen agente de selección es aquel que puede usarse en una dosis lo suficientemente alta como para impedir la viabilidad de las células no transformadas y lo suficientemente baja como para no dañar las células transgénicas e inhibir por tanto, su regeneración. Genes marcadores informadores Confieren una nueva propiedad a la célula transformada pero no son letales, es decir, no seleccionan las transformadas de las que no lo están (Ej. lacZ).

TIPOS DE VECTORES:El ADN del Fago landa es un cromosoma lineal de 45 Kb se ha secuenciado completamente para ser utilizado como vector. El tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN foráneo sin que ello afecte a la capacidad del fago de infectar bacterias y de formar su propia cápside para que se lleve a cabo su proceso replicativo.Para clonar ADN utilizando este vector, se purifica el ADN del fago y se corta con una enzima de restricción, con la misma enzima de restricción cortamos el fragmento de ADN de interés y los unimos con una ADN ligasa. Los vectores lambda recombinantes se empaquetan in vitro en las cápsides proteicas del fago, y se introducen en células huesped bacterianas. Dentro de las bacterias, los vectores se replican y forman muchas copias del fago infectivo, llevando todas ellas el fragmento de ADN de interés en la clonación. Los vectores fágicos pueden transportar fragmentos de hasta 23 kb. Posteriormente este DNA recombinante se introduce en el fago que se utiliza para infectar las bacterias

El fago landa ofrece la ventaja de poderse utilizar para clonar el ADN genómico. –LIBRERÍA DE ADN GENÓMICO O GENOTECA. Sirve para buscar ADN mediante la hibridación con sondas de ADN conocido… Secuencias cos: extremos 5’ protuberantes de 12 pares de bases. En determinadas condiciones cuando infecta a la bacteria este ADN puede recircularizar y comportarse como un plásmido. Las secuencias COS de los fagos sirven para el diseño de otros vectores denominados CÓSMIDOS que pueden empaquetar fragmentos de ADN aun más grandes. Cósmido: es un híbrido de fago y plásmido: con las secuencias cos de fago lambda y origen de replicación y resistencia a antibióticos de plásmido junto con sitio de múltiple clonaje. Los cósmidos recombinantes se encapsulan en partículas de fagos con capacidad infectiva y se replican como plásmidos en el interior de las células huésped (E. coli) sin ciclo lítico. Al final lo que tenemos son colonias de E. coli que contienen el cósmido.En un cósmido se pueden clonar hasta de 45 Kb.Para tamaños más grandes se emplean:e BAC (100-300 kb) Bacterial Artificial Chromosome, YAC (250-1000 Kb) Yeast Artificial Chromosome.

BAC:Derivan del plásmido de fertilidad (factor F) de E. coli. Pueden llevar fragmento de hasta 300 kb, aunque el tamaño medio suele ser de 100 kb. OriS: origen de replicación del factor F repE y parA, B, C: control de la replicación Chlmr: cloranfenicol acetil – transferasa (CAT) (gen de resistencia a cloranfenicol) LacZ y sitio de múltiple clonaje. Es un vector que pretende imitar las características de un cromosoma normal de una levadura (eucariota), portando un centrómero y telómeros terminales de humanos. Esto permite clonar en levaduras (microorganismos eucariotas) secuencias de ADN de hasta un millón de pares de bases o más, al comportarse como un cromosoma propio de la levadura. Lleva también un origen de replicación indispensable para la replicación de este plásmido si lo queremos introducir en una bacteria. Marcadores de selección y dianas de restricción que facilitan la clonación. Se replican dentro de la levadura como un cromosoma más.

PLÁSMIDO Ti: introducir ADN en el genoma de las plantas. Es un plásmido proveniente de una Agrobacteria que de manera natural introduce ADN dentro de la planta. Lo que introduce se encuentra entre el borde izquierdo y derecho de lo que se denomina región T. Toda esta región puede ser sustituida por el ADN que queramos introducir en planta.

VECTORES DE EXPRESIÓN BACTERIANOS: Producir proteínas en bacterias puede ser un método de interés para la industria y muy barato. Se han diseñado plásmidos que además de replicarse en la bacteria son capaces de transcribir el ADN foráneo que contienen y traducirlo a proteína. Contienen un sitio de unión a ribosomas (Ribosome Binding Site-RBS) en la secuencia para que se lleve a cabo la traducción. Está situado detrás del promotor de inicio de la transcripción (T7) y después del MCS tiene un terminador de la transcripción.

PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MARCADAS CON HISTIDINAS: El soporte consiste en agarosa con ácido nitrilotriacético que actúa como quelante de un metal, normalmente iones de níquel divalente (Ni 2+). De esta forma los iones de Ni 2+ quedan unidos por 3 enlaces a la columna a través del enlace que queda se unen las proteínas con las colas de histidina que se quieren purificar. Sólo quedarán retenidas aquellas que tengan histidina en la superficie, el resto sale de la columna. Las proteínas unidas al metal se separan de éste por la simple disminución del pH (al aumentar la acidez) las histidinas toman una carga eléctrica positiva -un protón (H+ )- con lo que pierden su capacidad de interacción con el metal inmovilizado en la matriz cromatográfica.

Tres niveles básicos de información biológica: Genoma: la información genética común a todas las células del organismo. Transcriptoma: la parte del genoma que se expresa en una célula en una etapa específica de su desarrollo. Proteoma: las proteínas que interactúan para dar a la célula su carácter individual.Metaboloma: colección de todos los metabolitos que produce una Unidad Biológica.

Genómica Se denomina genómica al conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al estudio integral del funcionamiento, el contenido, la evolución y el origen de los genomas. La genómica usa conocimientos derivados de distintas ciencias como son: biología molecular, bioquímica, informática, estadística, matemáticas, física, etc. El desarrollo de la genómica ha contribuido al avance de distintos campos de la ciencia como la medicina, la agricultura, etc. En la actualidad se cuenta además con importantes servidores de acceso público, como el del NCBI (National Center for Biotechnology Information), que permiten que cualquier usuario con conexión a Internet acceda a la secuencia completa del genoma de decenas de organismos y a las secuencias de cientos de miles genes de distintos org.

Genómica estructural:caracterización de la estructura de un genoma. Para ello sigue un orden creciente en su análisis:Asignar loci a cromosomas específicos. Cartografiado de alta resolución (empleo de marcadores moleculares, hibridación “in situ”…). Mapa físico de los genomas (obtención de clones solapados que contienen cromosomas enteros o genomas completos). Secuenciación completa del genoma. Con la secuenciación del genoma de las especies de mayor interés productivo ya completada o en vías de finalización, tanto en animales (pollo, vaca, oveja, cerdo…) como en vegetales (arroz, maíz, trigo, vid, manzana, melón…) se pueden obtener marcadores moleculares de gran utilidad. En la primera década de este siglo, se han desarrollado comercialmente la micromatrices (chips) de genotipado masivo, que permiten obtener con un coste razonable el genotipo de un individuo para un número muy grande de marcadores SNP. Los marcadores SNP (single nucleotide polymorphism) son polimorfismos que afectan a un único nucleótido, son extremadamente frecuentes en el genoma y están repartidos homogéneamente a lo largo del mismo. La disponibilidad de esta potencia de genotipado ha dado lugar a los desarrollos teóricos que fundamentan las estrategias de la selección genómica.¿Qué efecto tienen los SNP sobre los caracteres que observamos? Los SNP no tienen porqué formar parte de los genes. Pero, si están bien distribuidos a lo largo del genoma, muchos de ellos estarán próximos a zonas del DNA responsables de caracteres de interés, es decir, estarán asociados a genes. El objetivo será identificar estas asociaciones entre los SNP y las distintas características que interesa estudiar en los individuos. Por eso se dice que los SNP son “marcadores genéticos”.

Genómica funcional.- caracterización funcional de las secuencias de DNA. Actividades encaminadas a extraer la información sobre el papel de las secuencias del DNA de todos y cada uno de los elementos que componen el genoma, con particular atención a los genes. • (ORF= open reading frames, marcos abiertos de lectura) • Transcriptoma:conjunto completo de los transcritos producidos por un organismo. • Proteoma:colección completa de todas las proteínas cifradas en un genoma.

TRANSCRIPTÓMICA: Estudio de los perfiles de expresión de todos los genes presentes en el genoma. Distintos niveles de regulación de la expresión génica: – Estructura de la cromatina – transcripción – maduración mRNA – traducción: modificaciones post-traducción degradación. Los genes no se expresan aisladamente, existen redes de regulación de las funciones celulares que tienen como consecuencia la respuesta del organismo al momento de desarrollo y a las condiciones ambientales.  NORTHERN Análisis gen a gen: Se extrae RNA y se separa en un gel de agarosa. Se transfiere a una membrana y se hibrida con una sonda de un fragmento de DNA del gen del que queremos analizar su expresión Se observarán bandas positivas de mayor o menor intensidad según se esté expresando el gen en la muestra de RNA extraído. Se extrae mediante precipitación diferencialRNA/DNAácida y posterior tratamiento con DNAsa. FUSIÓN DE PROMOTORES A GENES INFORMADORES CUANTIFICABLES Análisis gen a gen: Fusión de la zona promotora del gen que queramos estudiar al gen de la b-glucuronidasa que en presencia del sustrato X-gluc produce coloración azul allí donde funciona el citado promotor activando la transcripción y posteriormente la traducción del gen informador. Fusión de la zona promotora del gen en estudio al gen que codifica la proteína verde fluorescente gfp. Excitando con luz azul o luz ultravioleta se produce fluorescencia allí donde el promotor está activo en transcripción. HIBRIDACIÓN in situ Análisis gen a gen: Se hibrida una sonda de RNA del gen de interés sobre cortes de tejido. La hibridación RNA-RNA nos revela las células en las que se expresa nuestro gen.  MICROARRAYS DE DNA Chips de DNA, micromatrices Análisis masivo de expresión de muchos genes:Los microarrays de DNA surgen de la necesidad de analizar la cantidad de información procedente de los grandes proyectos de secuenciación de genomas. • Permiten elaborar mapas finos de transcripción y supuestamente proporcionarían información indirecta de los niveles de proteínas. • El análisis de microarrays de DNA es una tecnología que permite estudiar simultáneamente la expresión de miles de genes bajo distintas condiciones experimentales. • Los microarrays de DNA constan de miles de conjuntos ordenados de moléculas de DNA de secuencia conocida depositados en un soporte sólido(~ 2 cm2 ) como cristal, nylon o silicio, sobre los cuales se puede hibridar muestras de RNA o cDNA. • Según su fabricación se pueden distinguir dos tipos: – chips de oligonucleótidos (oligos) fabricados “in situ” – chips fabricados por impresión ptos.

RNA seq: Análisis masivo de expresión de muchos genes: La secuenciación masiva de RNA de una muestra permite la elaboración de verdaderos catálogos de la expresión génica en tejidos diversos o estados fisiológicos de interés . También identificar la existencia de patrones alternativos en el ensamblaje de exones de un gen en tejidos o individuos distintos que pueden producir proteínas distintas. El RNA extraído se convierte en una librería de fragmentos de cDNA a través de la síntesis del cDNA y posterior fragmentación. Posteriormente se ligan los adaptadores de secuenciación (en azul y rojo) y se hace una secuenciación masiva de todos los fragmentos. Las lecturas resultantes (de los exones y de los fragmentos adyacentes al poliA) se alinean con el genoma de referencia. Existen tantas lecturas de cada fragmento como cDNAs sintetizados a partir de los mRNAs obtenidos. Cuanto más se expresa un gen en una condición determinada más mRNAs habrá, más fragmentos de cDNAs y más lecturas de los mismos hay.

Genómica comparada: Filogenómica: Campo de la genómica que estudia las similitudes y diferencias en el contenido de los genes, en sus funciones y en su organización, entre genomas de distintos organismos. El uso de secuencias del genoma completo para reconstruir la historia evolutiva de los organismos, o filogenómica, puede ser muy útil para resolver no sólo el Árbol de la Vida, sino también para contestar muchas cuestiones importantes sobre desarrollo, metabolismo, patogénesis, fisiología o comportamiento.

Dominio proteico: partes características de las proteínas generalmente asociadas con su función.

Proteómica: El término proteoma engloba todas las proteínas que se expresan a partir de un genoma. La proteómica considerada como disciplina científica o aproximación metodólógica, tiene como objetivo el estudio del proteoma presente en una unidad biológica (fracción subcelular, célula, tejido, órgano u organismo) en un momento determinado y bajo condiciones ambientales determinadas La descripción del proteoma permite tener una imagen dinámica de todas las proteínas expresadas, en un momento dado y bajo determinadas condiciones concretas de tiempo y ambiente. El estudio y comparación sistemáticos del proteoma en diferentes situaciones metabólicas y/o patológicas permite identificar aquellas proteínas cuya presencia, ausencia o alteración se correlaciona con determinados estadios fisiológicos.

Los estudios de proteómica se justifican porque: 1. Las proteínas son las biomoléculas encargadas de ejecutar la información impresa en los genes. 2. Se desconoce la función de la mayoría de los genes. 3. La transcriptómica proporciona una información incompleta ya que no tiene en cuenta las modificaciones postraduccionales. 4. La correlación entre el contenido celular de algunos RNAm y los niveles de proteínas es en muchos casos muy baja. ¿Qué tipo de estudios podemos hacer mediante el uso de la proteómica?: – Proteómica de expresión (expresión de proteínas entre muestras que difieren en alguna variable, ej: una persona sana y un enfermo diabético) – Proteómica estructural (estudio de localización de proteínas en un determinado tejido, tipo de célula…y sus interacciones con otras proteínas) – Proteómica funcional (estudio y localización de un grupo de proteínas determinado mediante diversos estudios comparativos, para averiguar redes de regulación proteica). ¿Cómo se caracteriza una mezcla proteica? 1. SEPARAR LAS PROTEÍNAS • Preparar la muestra. • Técnicas de separación: Electroforesis 2D. Cromatografía. 2. MEDIR ALGUNA PROPIEDAD INTRINSECA: • Masa, espectrometría de masas. 3. COMPARACIÓN CON BASES DE DATOS. • PMF = Peptide Mass Fingerprinting. Separación de proteínas en condiciones desnaturalizantes mediante tratamiento con el detergente Dodecilsulfato sódico (SDS). Todas las proteínas se desnaturalizan cargan negativamente y se separan por su peso molecular.

Electroforesis bidimensional 2D: La electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida puede usarse para separar las proteínas de una célula. El 2D-PAGE no detecta algunas proteínas que están en baja cantidad y es difícil de automatizar. Actualmente se prefiere la cromatografía líquida (HPLC High-performance liquid chromatography) para separar proteínas. Una mezcla de moléculas se disuelve en un líquido y se pasa a través de una columna empaquetada con partículas sólidas. Afinidades diferentes por la fase líquida y la fase sólida hacen que algunos componentes de la mezcla viajen más lentamente que otros a través de la columna, lo que genera su separación (láser a 280nm). La espectrometría de masas se utiliza para identificar proteínas Mary Lipton y col estudiaron el PROTEOMA de Deinococcus radiodurans 1.- Extracción de proteínas de la bacteria 2.- Digestión con tripsina 3.- Análisis de los péptidos con un espectrómetro de masa que determina la relación masa-carga. 4.- Determinación de las proteínas a partir de los fragmentos peptídicos con espectrometría de masa.

En cuanto al papel de los nutrientes en la salud y en la enfermedad, la genisteína que es la principal isoflavona de la soja. La genisteína se piensa que, entres sus diferentes funciones, tiene una función de protección frente a distintos tipos de cáncer, entre ellos el de mama. Unos investigadores en el año 2005 (Rowel C. J Nutr 2005) hicieron un experimento en ratas, a unas les indujeron químicamente cáncer de mama y a otras, además de inducirles el cáncer, les administraron genisteína. Mediante estudios de proteómica observaron modificaciones en 5 proteínas. Se centraron en la proteína GTP-CH1, que tiene especial relevancia en la regulación de otras proteínas relacionadas con el cáncer y proliferación celular. Lo que observaron fue que en el grupo que tomaba genisteína, la proteína GTP-CH1 estaba aumentada, lo que originaba una disminución de expresión de VFG2, que es una proteína relacionada con la proliferación celular y la susceptibilidad al desarrollo de cáncer. Estos investigadores demostraron en animales de experimentación que la genisteína tiene un papel protector frente al cáncer de mama. Estudios sobre composición y características de la dieta Se ha aplicado la proteómica en un estudio realizado en el año 2005 (D´Auria E. Acta Paediatr. 2005) para caracterizar distintas isoformas de las beta lactoglobulinas, de las que se piensa que son las principales responsables de la alergia a la leche de vaca. Se evaluaron distintas leches procedentes de diferentes mamíferos para valorar un posible sustituto a la leche materna, ya que la principal causa de alergia en edad infantil es debido a la ingesta de leche de vaca. Estos autores analizaron y compararon el proteoma de la leche de cabra, de oveja, de búfalo, de vaca, de yegua y de burro. Por desgracia, todas tienen una proporción mayor de beta lactoglobulina que la leche materna pero, curiosamente, desde el punto de vista de la proteómica, en cuanto a disposición de proteínas, número de isoformas y su expresión, las más parecidas a la leche materna son la de cabra y la de yegua.

Proteómica estructural Intenta determinar la estructura de las proteínas: ● cristalografía de rayos X ● resonancia magnética nuclear (RMN). La estructura en alta resolución de una proteína aporta una gran cantidad de información útil. Puede proporcionar indicios sobre las funciones de una proteína desconocida. Puede sugerir la ubicación de sus sitios activos y proveer información sobre otras moléculas que interactúan con la proteína. El conocimiento de la estructura de una proteína a menudo ofrece sitios diana para potenciales medicamentos que puedan interactuar con ella.

Interacciones proteína-proteína: El estudio del PROTEOMA , la proteómica en sí misma estudia también las interacciones proteína/proteína (ya que se sabe que la mayoría de las proteínas actúan en interacción con otras proteínas formando redes de señalización). Para ello existen principalmente dos técnicas que permiten la identificación de dianas de interacción con otras proteínas: Microarrays de proteínas, Sistema de doble híbrido. Microarrays de proteínas: El microarray consiste en una serie de proteínas (para analizar interacción proteína proteína) o anticuerpos seleccionados específicamente en función de las rutas o procesos biológicos que queramos analizar, permitiendo así caracterizar las muestras y comparar, por ejemplo, los niveles entre una muestra tratada y otra sin tratar. Desarrollo técnicamente complicado: Debido a la complejidad y diversidad estructural de las proteínas. Las proteínas no tienen una estructura homogénea ni un patrón de unión específico, sino que cada proteína posee unas características bioquímicas particulares en diferentes situaciones. Las conformaciones nativas de las proteínas deben mantenerse para que suceda la interacción. No existe una técnica equivalente a la PCR capaz de amplificar la cantidad de proteína en una muestra. No es fácil inmovilizar proteínas en una superficie.

Estudio de las interacciones entre proteínas (interactoma): Captura por afinidad: un anticuerpo para una proteína en especial se usa para capturarla a partir de una mezcla compleja. La proteína capturada será “arrastrada” junto con cualquier otra proteína que interactúe físicamente con ella. La mezcla arrastrada luego se analiza por espectrometría de masa para identificar las proteínas. Micromatrices de proteínas: a) micromatriz con 4.400 proteínas que se encuentran en la levadura b) micromatriz tratada con una enzima que fosforila, con objeto de determinar qué proteínas sirven de sustrato. Los puntos negros representan las proteínas que fueron fosforiladas por la enzima.

Yeast two-hybrid system. Sistema del doble híbrido Sistema para ver interacciones proteína/proteína. La técnica se basa en averiguar la interacción entre dos dominios A y B necesarios para que un factor de transcripción se una al DNA y transcriba un gen informador que da por ej. una coloración. Tenemos un plásmido con el dominio A y otro plásmido con el dominio B con un sitio adyacente de múltiple clonaje que permite clonar en masa fragmentos de DNA de un organismo en cada uno de los plásmidos.

Se transforman levaduras con ambos plásmidos, los genes clonados se transcriben y traducen fusionados a cada uno de los dominios A y B. Cuando A y B interaccionan se activa la transcripción de un gen informador . Esto solo ocurre si las proteínas fusionadas a A y B interaccionan. Este estudio no permite el análisis de interacción en masa, tan solo nos permite saber si dos proteínas concretas interaccionan.

Análisis de la interacción proteína-DNA: INMUNOPRECIPITACIÓN DE CROMATINA: Esta técnica tiene la ventaja de que se puede realizar in-vivo. • Por ejemplo, nos puede interesar si nuestra proteína regula la transcripción ante una situación de estrés. • Tras someter a las células a algún tipo de estrés, por ejemplo alta concentración de sales, se puede aplicar alguna sustancia como el glutaraldehido que fija el contenido celular. • Posteriormente mediante sonicación lisamos las células y rompemos el DNA en fragmentos de tamaño conocido. • Tendremos una mezcla de fragmentos de cromatina unida a proteínas. • Separamos nuestra proteína de interés del resto mediante un anticuerpo para esa proteína. • Ese anticuerpo lo tenemos unido a bolitas (de sefarosa) inertes. Tras aplicarlas a la muestra el anticuerpo se unirá a nuestra proteína que a su vez llevará unido el DNA. Tras centrifugar en el fondo del tubo quedarán las esferas con el complejo proteína-DNA. Finalmente separamos el DNA de la proteína y secuenciamos.

METABOLÓMICA: La metabolómica es una nueva rama en bioquímica analítica que está relacionada con el metabolismo – el proceso de conversión de energía de los alimentos en energía mecánica o calor. Estudia y compara los metabolomas, colección de todos los metabolitos (moléculas de bajo peso molecular que produce una unidad biológica): intermediarios del metabolismo hormonas moléculas señal metabolitos secundarios presentes en una célula, tejido u organismo en un momento dado. El metaboloma es muy dinámico, cambia ante la menor señal física o química, y debido a que son muchos los tipos de metabolitos que puede haber en una célula, también son varios los métodos que se emplean en el análisis. Para estudiar el metaboloma se necesita primero separar los metabolitos, y luego detectarlos. Actualmente se estima que hay más de 2.000 metabolitos diferentes que pueden ser sintetizados de forma endógena. Además la dieta incorpora metabolitos exógenos, como por ejemplo las vitaminas.

Para separarlos se suelen usar las técnicas de: cromatografía en fase gaseosa, cromatografía líquida de alta resolución (o HPLC), o electroforesis con capilares. Para la detección de los metabolitos, se emplean principalmente: la espectrometría de masa (MS) la espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN). Aunque se usan prácticamente en forma indistinta, para algunos autores los términos metabolómica y metabonómica hacen referencia a objetivos diferentes. Metabolómica cataloga y cuantifica a las moléculas pequeñas que se encuentran en los sistemas biológicos. Metabonómica estudia cómo cambian los perfiles metabólicos como respuesta a estreses, tales como enfermedades, tóxicos o cambios en la dieta.

La foodómica pretende ayudar a solventar los nuevos retos que la seguridad, la calidad y la trazabilidad alimentarias tienen que hacer frente. Entre ellos el análisis de contaminantes y alérgenos, el descubrimiento de biomarcadores para detectar productos peligrosos y la capacidad de detectar problemas de seguridad alimentaria antes de que afecten a los consumidores.

Nútrigenómica: Estudia el efecto de los nutrientes y sus componentes bioactivos en la expresión y respuesta de los genes.

Nutrigenética: Análisis de variaciones genéticas entre individuos y su respuesta clínica a nutrientes específicos.

Reto de la Nutrigenómica: modificar suceptibilidad genética a enfermedades a través de la alimentación personalizada. Además de estudiar la respuesta fenotípica a la dieta en función del genotipo, la nutrigenómica se propone averiguar el modo en que los nutrientes regulan la expresión de los genes, la repercusión de los polimorfismos en la expresión y regulación génicas y la interrelación entre los cambios operados y los procesos proteómicos y metabolómicos.

Epigenética: cambios heredables en la expresión génica que no van acompañados de cambios en la secuencia de DNA. La epigenética es una palabra de origen griego y significa literalmente por encima (epi) del genoma. • Modificación por el entorno: edad, dieta, tabaco… • No se trata por tanto únicamente de qué genes heredamos o no de nuestros padres, sino de si están “encend.” o “apagos” a través de interruptores epigen.