Coagulasa: detecta la presencia de una enzima que induce a la coagulación del plasma sanguíneo, al convertir el fibrinógeno en fibrina. Permite diferenciar S. aureus (C+) de los demás estafilococos (C-). 2 tipos de enzimas: Coagulasa libre o procoagulasa: enzima extra bacteriana que reacciona con un factor activador presente en el plasma de conejo, similar a la protrombina, dando lugar a un complejo análogo a la trombina que reacciona con fibrinógeno formando un coágulo de fibrina en ausencia de CA. Coagulasa ligada o factor de agregación: enzima presente en la superficie de la pared celular que actúa directamente sobre el fibrinógeno y lo convierte en fibrina.
ADNasa: Enzima extra que degrada el ADN del hospedador, incrementando el poder patógeno de la bacteria. Correlacionado con el test de coagulasa. Permite diferenciar S. aureus (+) de otros estafilococos (-) y Serratia marcescens (+) de enterobacterias y Klebsiella (-). Moraxella catarrhalis de Neisseria sp. Procedimiento: Utilización de ADNasa agar, inocular bacteria en una estría, incubar 18h a 37º, inundar la placa con una solución de HCl. ADNasa +: hidrólisis del ADN alrededor de la zona donde se inocula la bacteria (halo transparente), mientras que el resto de la placa aparecerá opaca como consecuencia de la precipitación del ADN. La reacción se puede visualizar tras la adición del HCl, que precipita el ADN del medio. Negativo: sin halo transparente alrededor de las colonias, viéndose todo el medio opaco.
Medio OF: Diferencial. Metabolización de la glucosa: Vía oxidativa (aerobia) y vía fermentativa (anaerobia). Medio color verde, indicador de pH: Azul bromotimol: Ácido: amarillo, alcalino: azul. Cada bacteria se inocula en dos tubos. No utilización de glucosa, no reacción en parte superior del tubo aerobio debido a la utilización de peptonas y no reacción en tubo anaerobio. Ej: Af aerobia. Vía O: crecimiento en parte superior del tubo aeróbico. Ej: PF. aerobia estricta. Vía F: crecimiento en ambos tubos. Ej: Ea. anaerobia facultativa.
Vía Fermentativa: Reacciones bioquímicas productoras de energía en las cuales las moléculas orgánicas pueden aceptar o donar electrones. La capacidad de los microorganismos para fermentar los carbohidratos y los tipos de productos formados son muy útiles para su identificación. Un carbohidrato puede ser fermentado en diferentes tipos de productos finales, dependiendo del microorganismo.
Caldo glucosado: Diferencial. Fermentación de glucosa y producción de gas. Empleado en bacterias entéricas (Gram -). Composición: glucosa (también puede ser lactosa o manitol), peptona. Tubo Durham: tubo invertido colocado en el interior del medio. Medio color rojo. Indicador de pH: rojo fenol. Ácido: amarillo, Alcalino: rojo. Formación de H2 y CO2, a partir de ácido fórmico por enzima. Observación de una «burbuja» en el tubo de Durham.
Agar MacConkey: Selectivo y diferencial (bacilos Gram- no exigentes). Sales biliares y cristal de violeta inhiben Gram+. Medio color rosado. Indicador de pH: rojo neutro. Ácido: rojo, Alcalino: ámbar. Fermentación de lactosa: + rojo o violeta (E. coli), – amarillas (P. aeruginosa).
CLED: Diferencial, empleado en urocultivo, deficiencia en electrolitos impide invasión de Proteus sp. Cistina permite crecimiento de bacterias más exigentes. Medio color verde. Indicador de pH: azul bromotimol. Ácido: amarillo, alcalino: verde o azul. Fermentación de lactosa: + amarillo y – verde o azul.
MSA: Selectivo y diferencial. Crecimiento de Staph. aureus (staph dorado). Al tener alto crecimiento de NaCl, inhibe Gram-. Medio rosa. Indicador de pH: rojo fenol. Ácido: amarillo, alcalino: rojo. Fermentación de manitol: + amarillo rodeadas de un halo amarillo, – rosadas o blancas, halo púrpura.
Medio Kliger: Medio diferencial complejo: manifiesta varias características enzimáticas. Medio color rojo: intubado en pico de flauta con un fondo y una pendiente. Indicador de pH: rojo fenol. Ácido: amarillo, alcalino: rojo. Siembra en la superficie del agar (aerobiosis) y en profundidad (anaerobiosis). Lectura diferencial: fondo: glucosa y pendiente: lactosa. Producción de gas. Producción de H2S: reducción del tiosulfato, reacción con Fe y formación de sulfuro de Fe.
No fermentación: sin cambio de color en el slant. Fermentación de glucosa: viraje a color amarillo en la superficie del slant. Fermentación de lactosa: viraje a color amarillo en la superficie del slant. Producción de gas: burbujas de H2 y CO2, rotura o elevación del agar del fondo del tubo. Producción de ácido sulfhídrico: precipitado negro en el fondo del tubo.
Medio Citrato: sintético y diferencial. Usado para valorar la metabolización del citrato como fuente única de carbono. Presencia de la citrato permeasa. Composición: citrato con fuente de carbono y fosfato de amonio como fuente de nitrógeno. Medio color verde. Indicador de pH: azul de bromotimol, alcalino: azul. Metabolización del citrato: + crecimiento bacteriano y medio azul (Klebsiella), – sin crecimiento y medio verde (E. coli).
Antibiograma: test de susceptibilidad de una bacteria a los agentes antimicrobianos. No todas las bacterias tienen la misma sensibilidad. Determinada por la concentración mínima inhibitoria, la menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento de una cepa bacteriana. Se pueden emplear diferentes metodologías: difusión por discos (método Kirby-Bauer), difusión en gradiente (E-test), dilución en agar o caldo. Difusión en Discos: se basa en la inhibición del crecimiento de la bacteria alrededor de un disco cargado de antimicrobiano. Se siembra la bacteria en la superficie de un medio de cultivo, sobre el que se depositan unos discos cargados de antibiótico, que se difunden a través del agar, formándose un gradiente de concentración. Características estándar: pH 7.7-7.4, grosor 4-6 mm, medio de cultivo empleado: Mueller Hinton. Discos de antibióticos con la cantidad establecida. Inóculo bacteriano = 0.5 McFarland. Inoculación con hisopo estéril. Incubación a 37º, lectura realizada entre 18-24h. Útil para bacterias patógenas de crecimiento rápido.
Medición del diámetro de los halos de inhibición en mm. Tamaño de los halos depende de la sensibilidad de la bacteria al antibiótico. Clasificación del organismo en resistente, intermedio y sensible. Interpretar según los resultados obtenidos en las normas NCCLS.
Factores que afectan al tamaño del halo: carga de antibiótico en los discos, difusión del antibiótico en el medio de cultivo, tamaño del inóculo, composición y grosor del medio de cultivo, desecación excesiva del medio de cultivo, tiempo de incubación, etc.
Tipos de Hemólisis: Alfa: (incompleta) se refiere a una lisis parcial de eritrocitos que produce una coloración verde que se observa alrededor de las colonias debido a la bili-verdina que degrada la hemoglobina. La hemólisis beta (completa) se refiere a un halo translúcido alrededor de las colonias y la hemólisis gamma (no hemólisis) se refiere a la ausencia de hemólisis.