Guía de Biología Molecular 3er Parcial
1. Procedimiento que permite determinar, a través del análisis de los marcadores de ADN, la relación biológica entre dos personas
Prueba de paternidad
2. Permite identificar a cada persona gracias a que todos tenemos una secuencia única, misma que permanece invariable a lo largo de la vida de las personas
Huella genética
3. Las formas variables de proteínas tales como las de los grupos sanguíneos se explican mediante
Polimorfismos bioquímicos
4. Pruebas confirmatorias para el VIH
C. Western Blot y ELISA
5. Concentración adecuada de agarosa para separar un fragmento de ADN de 200 pb. 1.5%
6. Concentración adecuada de agarosa para separar un fragmento de ADN de 12 kb 0.7%
7. Cambios o variaciones en la secuencia de un gen o de una secuencia de ADN que permiten establecer la huella genética de un individuo y dan viabilidad a los individuos de una misma especie
Polimorfismos
8. Marcador genético utilizado para determinar el sexo genético en muestras forenses
AMEL (Amelogenina)
9. Personas involucradas para la realización de una prueba de paternidad en un caso simple
Presunto padre, hijo(a), madre biológica
10. Diferencias de la secuencia nucleotídica que no son mutaciones ni están asociadas a patologías
Polimorfismos nucleotídicos
11. Se dice que se excluye la paternidad cuando: Cuando tres o más alelos analizados en la prueba de paternidad no se comparten entre el hijo(a) y el presunto padre
12. Se dice que no hay exclusión de la paternidad cuando: Cuando entre el hijo(a) y el presunto padre se comparte la información de los marcadores genéticos analizados
13. Se dice que no es una prueba no concluyente de la paternidad cuando: Cuando se obtiene exclusión en menos de tres marcadores genéticos analizados y el parámetro de W no alcanza el 99.9%
En un procedimiento de aislamiento de ácidos nucleicos
1
4. El fenol se utiliza para desnaturalizar las proteínas: Verdadero
15. La fase superior, acuosa, contiene los contaminantes proteicos y lipídicos: Falso
16. Los ácidos nucleicos se recuperan por precipitación con etanol: Verdadero
17. El ARN se recupera por centrifugación a baja temperatura: Verdadero
18. Tipos de polimorfismos que pueden observarse en un individuo completo
Polimorfismos fenotípicos
FENOL CLOROFORMO
1- Lisis celular para llegar al núcleo: se debe lisar la membrana celular usualmente con SDS (duodecil sulfato de sodio) que es un detergente para disolver las lipoproteínas de la membrana. También se usan algunas sales y proteinasa K
2- En los microtubos (donde cabe máximo 1 ml de muestra) tenemos una mezcla se sustancias, pero solo necesitamos ADN. En este paso se pretende extraer lípidos y proteínas. Se hace con fenol-cloroformo
3- Precipitación del ADN con isopropanol o alcohol absoluto. Los alcoholes atrapan el ADN
4- Lavados en alcohol al 70% mínimo 3 veces
5- Disolución del ADN. Se añade ARNasa para eliminar el ARN
Duración de la prueba: 24 horas
Con kit de extracción (lo que más se usa): en unas pocas horas
ELECTROFORESIS
paso 1: preparación del gel de agarosa a concentración apropiada para separar el fragmento de DNA:
Dependiendo del tamaño de los fragmentos que queremos separar, será la cantidad de agarosa que usaremos
0.5% para separar fragmentos de 1-30 kB
1.5% para separar fragmentos de 0.2-3 pB
Esto es porque a mayor concentración, las partículas de agarosa estarán más unidas y las moléculas de ADN tendrán mayor dificultad para migrar hacia la superficie
Paso 2: cargar las muestras de ADN en el gel en los pocillos a un determinado voltaje y periodo de tiempo para poder alcanzar la separación óptima del material genético
Paso 3: tinción y observación. se tiñe el gel con bromuro de etidio y se observa en el transiluminador de luz UV. El bromuro de etidio se intercambia entre el ADN o sea (se mete en su cadena) y emite la luminosidad que nos permitirá observar las bandas de ADN.
Se utiliza la regla para medir las pares de bases
PCR (reaccion en cadena polimerasa)
¿Cuál es el fundamento de la prueba de PCR?
Tiene como fundamento la replicación del ADN
Menciona los 4 PASOS que requiere la PCR
1- Desnaturalización del ADN: En esta fase hacemos el trabajo de la helicasa y la topoisomerasa para tener la hebra con la doble hélice abierta
2- Alineamiento de los primers: no hay primasa, pero nosotros agregamos los primers con oligonucleótidos. El primer detecta su complementario
3- Extensión. Corresponde a la elongación de la cadena.
4- Terminación o programa de extensión.
¿de que depende la temperatura y el número de ciclos que se usan en la PCR?
De la muestra (gen) que se quiere replicar
nota: no se preguntará temperatura, tiempo, etapas, etc.
¿Que utilidad clínica tiene la prueba de PCR?
Permite detectar
1. Mutaciones
2. DNA exógeno (p. ej test de covid-19)
Son los dos primers (cebadores) que se añaden a la hebra molde durante la PCR
Primer Forward (delantero) y primer reversa (donde termina)
¿Que función tienen los 2 primers en la PCR?
Delimitan a partir de donde y hasta donde se va copiar el fragmento de ADN
¿Cuáles son los Dntps (desoxirribonucleósidos)?
A, G, T, C
¿cómo se realiza la desnaturalización del ADN?
con 1 ciclo de temperatura de 94°C durante 7 minutos
¿Cómo se unen los primeres al ADN muestra?
Por complementariedad (ley de chargaff)
Extensión:
El de arriba es el forward y el de abajo el stop. A la derecha nos dice el tamaño del amplicón
TÉCNICA DE SECUENCIACIÓN
¿para que sirve la técnica de secuenciación de ADN?
Sirve para determinar el orden de los nucleótidos (bases nitrogenadas) de una secuencia específica
Explica en que consiste la técnica de secuenciación del ADN
Lo que se hace es con el ADN codificado de una muestra y de ese fragmento, pero a cada dntp la tiñen de un color
Copias la secuencia que se esta estudiando y te diriges al gen bank del NIH
Al buscar la secuencia de los nucleótidos en el gen bank nos dará resultados sobre el gen al que corresponde esa secuencia. Su localización, tamaño, la secuencia viene al final de la página que nos proporciona toda la información sobre el gen.
en Gen bank podemos observar la secuencia completa del gen, locual nos sirve para confirmar que el gen que amplificamos corresponde a una proteína.
La secuenciación nos sirve para hacer alineamientos nucleotídicos es decir comparar secuencias, como en el virus de covid que tiene demasiadas mutaciones, podemos comparar las secuencias del gen del virus en busca de diferencias y mutaciones entre distintas muestras
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
¿Como se descubrieron las enzimas de restricción?
Las bacterias también son susceptibles al ataque de virus bacteriófagos y como defensa tienen enzimas de restricción llamadas endonucleasas que al detectar el ADN viral, lo cortan
¿Quiénes descubrieron las enzimas de restricción?
Fue descubierto en 1952 por el equipo del fago
¿Qué función tienen las enzimas de restricción?
Nos permite cortar el ADN en sitios de reconocimiento, sitios blanco, sitios diana
¿Cuántos tipos de enzimas de restricción existen y cual es la de mayor interés?
1, 2, 3 realizan el corte de diferente manera
Menciona la enzimas de restricción que se utilizan en biología molecular, son las únicas que realizan el corte justo donde reconocen el sitio blanco
Tipo 2
Función de las enzimas de restricción tipo 2
Sirven para cortar un gen y pegar otro gen de interés mediante una ADN ligasa. Podemos hacer ADN recombinante, clonación (copias de DNA)
Muchos medicamentos se hacen utilizando enzimas de restricción para clonar el ADN
Tipos de corte que realizan las enzimas de restricción
Romos y cohesivos
Son secuencias palindrómicas las que reconoce (que se leen igual al derecho y al revés. Los cortes romos nos sirven para nada, los cohesivos son los que nos interesan
¿Cómo hacer una proteína recombinante? Por ejemplo, la insulina recombinante
Se utilizan vectores de clonación. Por ejemplo, un plásmido (ADN circular)
Tiene sitios de corte y deja un espacio en el cual podemos insertar un gen que deseamos, lo pegamos con enzima ligasa, asi obtenemos un ADN recombinante hecho de ADN plasmídico + ADN humano
Proceso de obtención de Insulina recombinante:
Partimos de tener el gen de la insulina aislado (gen de interés) y nuestro plásmido. El plásmido tiene sitios de digestión para una enzima de restricción, lo cortamos, agregamos el gen que deseamos, pegamos con ligasa, insertamos el plásmido recombinante a una célula bacteriana. Reproducimos la bacteria y conforme se replica el cromosoma bacteriano también se replica el gen de interés y se va sintetizando la insulina que aislamos, purificamos y la comercializamos. La que se comercializa es la insulina de acción rápida (es la única insulina recombinante)