Interés de la Variación Extraespecífica en la Mejora

• Obtención de híbridos con las características de interés de las dos especies utilizadas (transferencia de información genética).
• Obtención de híbridos cultivables directamente (ornamentales, patrones de frutales).
• Desarrollo de nuevos alopoliploides con interés agrícola.
• Transferencia de uno o varios caracteres de interés de una especie a otra.
• Cruces entre especies cultivadas.
• Cruce entre una especie cultivada y una silvestre.
• Obtención de formas de adición y de sustitución interespecíficas.

. Formas de adición: Monosómicas n»(A, complemento cromosómico de una especie) + 1(B, un cromosoma de otra especie). Disómicas: n»(A) + 1»(B).

. Formas de sustitución: (n-1)»(A, complemento cromosómico de una especie a excepción de un par de cromosomas homólogos) + 1»(B, par de cromosomas homólogos de otra especie).

Barreras de Cruzabilidad

• Precigóticas:
  • Germinación del polen.
  • Desarrollo del tubo polínico en el estilo.
  • Fertilización.
• Postcigóticas:
  • Desarrollo del embrión.
  • Esterilidad del híbrido.

Técnicas para Superar las Barreras de Cruzabilidad

• Precigóticas: En el estilo, en el estigma, en la fertilización.

Detención del crecimiento de los tubos polínicos debido a barreras precigóticas.

Superación de Barreras Estigmáticas:

• Por polinización efectiva: el polen debe ser transferido al lugar correcto, en el momento adecuado y convenientemente hidratado.
• Por utilización de polen mensajero: polen inviable del parental femenino.

Superación de Barreras Estilares:

• Uso de reguladores de crecimiento (I): se estimula el crecimiento del tubo polínico y el desarrollo del embrión (Giberélico, indolacético, naftalenacético). La aplicación se hace en el ovario, base del estilo o estigma.
• Uso de reguladores de crecimiento (II): estimulación de la germinación y desarrollo del tubo polínico (ácido bórico, nitrato cálcico, inmunosupresores).
• Amputación del estilo: los problemas asociados a esta técnica son la germinación pobre y la orientación incorrecta de los tubos polínicos.

Fertilización:

• Mezcla de polen.
• Cruces recíprocos.
• Uso de la variación intraespecífica en cruces interespecíficos (selección de líneas con buena cruzabilidad).
• Empleo de líneas puente.

• Postcigóticas:
  • Eliminación de órganos competitivos.
  • Manipulación del nivel ploídico. Ej. 2n = 4x = 48 * 2n = 4x = 24 (no viable) –> duplicación cromosómica: 2n = 4x = 48 * 2n = 4x = 48 (viable).
  • Cultivo de: ovarios, óvulos y embriones.

Cultivo de Óvulos:

• Los ovarios se recolectan a partir del día siguiente a la polinización.
• Se extraen los óvulos.
• Se cultivan en medio suplementado con reguladores de crecimiento (nicotiana).

Cultivo de Ovarios:

• Se separan los ovarios del resto de la flor de 2 a 15 días tras la polinización.
• Se cultivan en medio suplementado con reguladores de crecimiento.
• Cuando los embriones son visibles se escinden y cultivan en medio.

Cultivo In Vitro de Embriones Inmaduros

• Fases de desarrollo del embrión: Suspensor, embrión, cotiledones, ápice.
• Causas del aborto del embrión:
  • Anomalías mitóticas en el endospermo híbrido.
  • Fallo en la nutrición (anormalidades en el suspensor, degeneración temprana del endospermo).
• Estado de desarrollo y requerimientos nutricionales:
  • Fase heterotrófica: el embrión depende de los aportes nutricionales del endospermo y de los tejidos maternos.
  • Fase autotrófica: el embrión es metabólicamente capaz de sintetizar sustancias necesarias para su desarrollo a partir de sales minerales y azúcar.
• Componentes del medio de cultivo:
  • Sales minerales
  • Fuente de carbohidratos: sacarosa (mantiene osmolaridad del medio). Concentraciones altas son efectivas para embriones en estadíos muy tempranos.
  • Aminoácidos y vitaminas: estimulan el crecimiento del embrión.
  • Reguladores del crecimiento (auxinas, citoquininas, giberelinas)
  • Extractos naturales de plantas (leche de coco).
• Desarrollo del embrión en el medio de cultivo:
  • Vía embriogénica: a partir de fase corazón.
  • Vía organogénica: embrión en fase globular.

Hibridación Somática

• Proceso: Fusión de protoplastos.

Protoplasto parental A * Protoplasto parental B (se fusionan).

Crecimiento de callos híbridos / selección / regeneración de plantas híbridas / enraizamiento y cultivo de las plantas híbridas (caracterización).

Hibridación Somática Simétrica:

(Protoplasto parental A) * (Protoplasto parental B), si son conocidos anfidiploide = heterocarión – alopoliploide.

Hibridación Somática Asimétrica:

Protoplasto donante (inactivación física del núcleo) * Protoplasto receptor = heterocariones – introgresión, líneas de adición.

• Requerimientos para la aplicación de la fusión de protoplastos:
  • Técnicas de aislamiento y fusión de protoplastos que permita elevadas frecuencias de fusión.
  • Sistemas adecuados para la identificación y selección de los híbridos somáticos.
  • Protocolo de regeneración de plantas a partir de los protoplastos.
  • Métodos adecuados de caracterización para verificar la naturaleza híbrida del material seleccionado.
• Técnica de aislamiento de protoplastos:
  • Exposición del material a la acción de dos enzimas:
    • Macerocima: liberación de células libres.
    • Celulasa: digestión de la pared celular y liberación de protoplastos.
• Métodos de inducción de fusión de protoplastos:
  • Agentes químicos:
    • pH elevado y alta concentración de iones Ca²⁺

(50 mM CaCl₂ * 2H₂O)

Polietilenglicol (menor toxicidad).Combinación de ambos.Método de electrodifusión:

• Formación de dipolos celulares y cadenas de perlas:
  • “Aparecen” las líneas de fuerza del campo eléctrico.
  • Se reordenan las cargas en la membrana y se forman los dipolos celulares.
  • Se alinean los protoplastos en un campo de corriente alterna y se forman las cadenas de perlas.
• Cambios moleculares producidos durante la electrodifusión:
  • Las membranas de células vecinas entran en contacto (dielectroforesis).
  • Rotura reversible de las paredes de la membrana plasmática.
  • Reconstrucción de la membrana tras la difusión.

Identificación y selección de híbridos somáticos:

• La fusión de protoplastos da lugar a:
  • Protoplastos de cada parental
  • Productos de fusión: homocariones, heterocariones.
• Métodos de:
  • Identificación visual (callos verdes * callos marrones = callos intermedios).
  • Empleo de medios de cultivo semiselectivos.
  • Combinación de distinto potencial morfogenético e inactivación química de los protoplastos.
  • Diferencias en la tasa de crecimiento.
  • Separación celular mediante citometría de flujo. Utiliza un mutante albino (iluminación con luz UV).
  • Expresión de genes marcadores.

Regeneración de plantas a partir de protoplastos:

• Depende de:
  • Condiciones de crecimiento de las plantas.
  • El tejido donante.
  • La técnica de aislamiento de los protoplastos.
  • El método de cultivo de los protoplastos.