Fundamentos de las Pruebas Bioquímicas en Microbiología

Las pruebas bioquímicas determinan la actividad de una vía metabólica de la bacteria a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria, al crecer, transforma o no. Hay que partir de un cultivo puro obtenido en el aislamiento, subcultivando de una colonia bien aislada. Es aconsejable realizar una comprobación efectuando una siembra en placa en la que crezcan únicamente colonias del mismo tipo.

Los microorganismos pueden ser separados e identificados debido a una gran variedad de razones:

• Determinación de patógenos responsables de enfermedades infecciosas.
• Selección y aislamiento de cepas de microorganismos fermentativos necesarios para la producción industrial de alcoholes, solventes, vitaminas, ácidos orgánicos, antibióticos e enzimas industriales.
• Aislamiento y desarrollo de cepas microbianas que puedan ser utilizadas para la producción de alimentos y mejoramiento de su sabor, como son el yogur, quesos y productos lácteos.
• Comparación de actividades bioquímicas con propósitos taxonómicos que permitan la identificación de una gran diversidad de especies bacterianas.

Importancia de las Pruebas Bioquímicas

Las pruebas bioquímicas sirven para detectar propiedades fisiológicas y bioquímicas, debido a que estas demuestran la existencia de ciertas enzimas en las vías metabólicas, que son reflejo de la expresión de un determinado gen en el DNA bacteriano.

La suma total de todas las reacciones químicas es definida como metabolismo celular, y las transformaciones bioquímicas que ocurren dentro y afuera de la célula se encuentran gobernadas por catalizadores biológicos llamados enzimas.

Clasificación y Función de las Enzimas

Las enzimas son proteínas muy específicas que realizan solo una reacción química en el metabolismo de la bacteria; son producidas en la célula, pero de acuerdo al lugar donde efectúan su acción se pueden clasificar en endoenzimas y exoenzimas.

Según sus propiedades, las enzimas se pueden clasificar en:

Enzimas Extracelulares

Son excretadas a través de la pared celular para producir los cambios en los nutrientes del medio ambiente y permitir el ingreso de estos a la célula. Ejemplos:

• Hidrólisis del almidón
• Hidrólisis de los lípidos
• Hidrólisis de la caseína
• Hidrólisis de la gelatina

Enzimas Intracelulares

Son endoenzimas que tienen reacción de degradación y síntesis de sustrato en el interior de la célula. Ejemplos:

• Fermentación de los carbohidratos
• Reacción de la leche tornasolada
• Producción del sulfuro de hidrógeno
• Reducción de los nitratos
• Reacción de la catalasa
• Test de la ureasa
• Test de la oxidasa
• Test de la coagulasa
• Hidrólisis de la sangre

Pruebas IMViC

Incluyen:

• Indol
• Rojo de Metilo
• Voges-Proskauer
• Utilización de Citrato

Agar Tres Azúcares Hierro (TSI)

Las pruebas a estudiar se recomienda utilizar en forma de control las siguientes especies de microorganismos en cultivo puro: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Shigella dysenteriae, Salmonella typhimurium, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus.

Procedimiento General para la Identificación Bioquímica

1. Cultivar el microorganismo en un medio adecuado, por ejemplo, que contenga el sustrato a metabolizar.
2. Incubar a una temperatura adecuada.
3. Detectar la formación o no de productos degradados o sintetizados:

• Por incorporación en el medio de algún sistema indicador, por ejemplo, rojo de metilo.
• Por adición posterior al medio de reactivos que revelen la presencia del compuesto formado, por ejemplo, KOH.

Respiración Bacteriana

La respiración involucra fenómenos de oxidación de un sustrato, lo cual ocurre por pérdida de electrones, adición o pérdida de hidrógeno. De acuerdo con la forma en que las bacterias captan el oxígeno molecular, se clasifican en aerobios estrictos, anaerobios facultativos y anaerobios estrictos.

Prueba de la Catalasa

La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo, la excepción principal es el género Streptococcus. Cuando hay oxígeno, se produce la descomposición aerobia de los azúcares. El peróxido de hidrógeno H₂O₂, si se acumula, es tóxico para las bacterias y causa su muerte. Se siembra en una placa el microorganismo que queremos analizar. Se añade una gota de agua oxigenada (peróxido de hidrógeno) al 3% y se observa el resultado de la reacción. Para la realización de esta prueba, se utiliza un cultivo de 18-24 horas de incubación de Escherichia coli o Staphylococcus aureus. La prueba positiva produce burbujas, producto del oxígeno liberado. La prueba negativa no da producción de burbujas.

Prueba de la Oxidasa

Esta prueba sirve para determinar la presencia de la enzima citocromo oxidasa.

La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo que activa la oxidación del citocromo reducido por el oxígeno, el que a su vez actúa como aceptor de electrones en la etapa terminal del sistema de transferencia de electrones. Todas las especies que producen una enzima oxidasa, cuando se encuentran en presencia de oxígeno atmosférico, citocromo C y un reactivo de oxidasa, oxidan el reactivo para formar un compuesto coloreado. Los colorantes para esta prueba son aceptores de electrones artificiales, actuando como reductores del sistema citocromo C oxidasa; el reactivo N,N dimetil, 1,4 fenilendiamina clorhidrato es a la vez aceptor y dador de electrones.

La prueba se realiza utilizando un papel filtro que se impregna con el reactivo oxidasa en una solución acuosa al 1%, el cual es muy sensible a la luz y al aire. El cultivo de los microorganismos debe ser de 18-24 horas, sembrados en agar inclinado. Se toma un inóculo del cultivo y se coloca en contacto con el papel filtro impregnado con el reactivo de oxidasa. La reacción positiva se verá al obtener un color violeta oscuro al extender la masa bacteriana sobre el papel de filtro impregnado con el reactivo de oxidasa. La reacción negativa no dará coloración. Se utilizan los microorganismos Escherichia coli (negativo) y Pseudomonas aeruginosa (positivo) para esta reacción.

Metabolismo de Compuestos Orgánicos

COMPUESTOS ORGÁNICOS: Los microorganismos utilizan una gran variedad de compuestos orgánicos, incluyendo carbohidratos. Los polisacáridos, trisacáridos y disacáridos son muy complejos para entrar en la célula bacteriana, por lo que primero son catabolizados a monosacáridos, siendo estos una fuente energética de muchos microorganismos. Las vías y los productos finales de la fermentación dependen del sustrato, de las enzimas presentes y de las condiciones en las que se lleva a cabo la reacción. Las bacterias pueden clasificarse en fermentadores con producción de ácido y fermentadores con producción de ácido y gas.

Algunas bacterias pueden fermentar la glucosa anaeróbicamente, otras la oxidan y algunos microorganismos pueden metabolizarla por ambos mecanismos, mientras otras bacterias son incapaces de utilizarla.

Los productos finales detectables, característicos en una prueba bioquímica relacionada con carbohidratos son: ácido láctico, ácido láctico y fórmico, ácido láctico y alcohol etílico (etanol), acetilmetilcarbinol (acetoína) y dióxido de carbono, etanol, ácido succínico —–> ácido propiónico y CO_2, CO₂ y acetona a alcohol isopropílico, ácido butírico a butanol.

Fermentación de Carbohidratos

En estas pruebas se determinará la habilidad de un microorganismo de degradar y fermentar carbohidratos con la producción de un ácido o ácido y gas.

Muchos microorganismos obtienen su energía a través de una serie de reacciones enzimáticas ordenadas e integradas conduciendo a la biooxidación de un sustrato, frecuentemente un carbohidrato. Las vías por lo que este proceso ocurre son:

• Respiración celular aeróbica: Biooxidación en que el oxígeno molecular puede servir como aceptor final de electrones.
• Respiración celular anaeróbica: Biooxidación en que iones inorgánicos diferentes del oxígeno, como son NO₃^– o SO₄⁼, pueden servir como aceptores finales de electrones.
• Fermentación: Un proceso biooxidativo que no requiere la presencia de oxígeno y en donde un sustrato orgánico sirve como aceptor final de electrones.

Los microorganismos pueden utilizar los carbohidratos diferencialmente dependiendo de su complemento enzimático. Algunos microorganismos son capaces de fermentar azúcares como la glucosa anaeróbicamente, mientras que otros solo pueden utilizar la vía aeróbica. Los microorganismos denominados anaerobios facultativos son enzimáticamente competentes, dado que utilizan ambos procesos, el anaeróbico y el aeróbico.

Actividad Enzimática Extracelular

Estas macromoléculas tienen que ser hidrolizadas por enzimas extracelulares específicas a sus componentes más básicos. Estos componentes extracelulares de bajo peso molecular pueden ser transportados al interior de la célula y ser utilizados para la síntesis de requerimientos citoplasmáticos y producción de energía.

Hidrólisis del Almidón

Es una molécula de alto peso molecular, polímero lineal compuesto de moléculas de glucosa unidas a través de enlaces glucosídicos. La degradación de esta macromolécula primero requiere de la presencia de una enzima extracelular llamada amilasa para hidrolizar a polisacáridos más cortos, llamados dextrinas, y por último a moléculas de maltosa. La hidrólisis final de este disacárido, que es catalizada por la maltasa, lleva a esta a moléculas de glucosa, sustrato de bajo peso molecular, soluble en agua, que puede ser luego transportada dentro de la célula y ser utilizada para la producción de energía para llevar a cabo los procesos de la glucólisis. En este procedimiento experimental, el agar almidón es utilizado para demostrar la actividad hidrolítica de la exoenzima amilasa. El medio está constituido de agar nutritivo suplementado con almidón, que sirve como sustrato a degradar. El almidón debe ser agregado a una concentración del 1%. Se esteriliza el medio y luego de enfriado a 50ºC se plaquea en placas estériles, se deja solidificar y luego se seca en la estufa para extraer el exceso de agua de la superficie del agar.

Se siembran los microorganismos que se le indique en el laboratorio y luego se lleva a estufa a la temperatura adecuada durante 24-48 horas. Pasado este tiempo se realiza la lectura de la prueba agregando lugol directamente a la placa. La reacción típica del almidón con el lugol es la formación de una coloración azul-pardo. Un halo incoloro alrededor del inóculo indica la hidrólisis del almidón y, por lo tanto, el microorganismo es amilasa positivo.

Si existe una coloración azul inmediatamente alrededor del cultivo se considera negativa, pues es la reacción típica del almidón que no ha sido hidrolizado por el microorganismo, debido a que no posee la exoenzima.

Hidrólisis de la Gelatina

Es una proteína proveniente de la hidrólisis del colágeno, uno de los componentes importantes del tejido conectivo y de los tendones en los humanos y otros animales.

Las proteínas que se producen naturalmente son demasiado grandes para entrar en la célula bacteriana. El catabolismo de las proteínas es un proceso en dos etapas.

Se prepara medio agar nutritivo y se agrega gelatina al 1%. Se funde el medio y luego se esteriliza en autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Una vez esterilizado, se plaquea y deja enfriar. Se siembran los microorganismos problemas y se incuban a la temperatura adecuada durante 24-48 horas. La lectura de esta prueba se realiza agregando a la placa el reactivo de Frazier.

Se disuelve el cloruro de mercurio en al ácido y luego se afora a 100 ml con agua destilada. Se filtra si es necesario. La prueba positiva que indica la presencia de la exoenzima gelatinasa se ve por la presencia de un halo claro en torno al crecimiento del microorganismo. Si no existe este halo claro la prueba se considera negativa.

Diagrama de la Glucosa

Una molécula de glucosa es convertida en dos moléculas de ácido pirúvico, que es el compuesto intermediario producido al ser degradada la glucosa.

La degradación de la glucosa para ver la producción de ácido y gas se lleva a cabo en un tubo de ensayo que contiene en su interior una campana Durham invertida para poder detectar la producción de gas. Un medio típico para ver esta reacción contiene:

• Ingredientes de un caldo nutritivo que favorecen el crecimiento.
• Un carbohidrato específico que sirve como sustrato para determinar la capacidad del organismo de producir ácido y gas del mismo.
• Un indicador de pH que generalmente es el rojo fenol, pero para fines prácticos se prefiere el púrpura de bromocresol.

Esta prueba se efectúa a las 24 horas y no más allá de 48 horas. La reacción positiva de esta reacción tiene que dar un color amarillo intenso, lo cual indica que el carbohidrato en estudio produjo ácidos que hicieron virar el indicador de un color púrpura intenso inicialmente a uno amarillo.

Los microorganismos que no son capaces de utilizar el carbohidrato no producen cambios en el indicador de pH, y los tubos aparecen de color púrpura, no hay acompañamiento de producción de gas. Esta reacción es negativa.

Utilización de Peptona por Microorganismos Incapaces de Utilizar Carbohidratos

Las peptonas pueden ser degradadas por las enzimas microbianas a aminoácidos que son luego convertidos por desaminación oxidativa en ceto aminoácidos. Estos son metabolizados a través del ciclo de Krebs para producir energía. Esta reacción libera iones amonio, los que se acumulan en el medio formando hidróxido de amonio (NH₄OH) y producir un ambiente de tipo alcalino. Cuando esto ocurre, el púrpura de bromo cresol da un color púrpura más intenso.

Preparar caldo nutritivo y se añade glucosa al 1% más el indicador de pH, el púrpura de bromocresol, es preparado en una solución acuosa aparte al 0,05%. El medio queda de un color azul morado.

Luego distribuya el medio a razón de 5 a 7 ml en tubos que contienen en su interior una campana Durham. Luego esterilizar a 121ºC por 10 minutos, dado que los azúcares por más tiempo se pueden caramelizar. Una vez frío el medio se siembra cada tubo con los microorganismos problemas como pueden ser, por ejemplo, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, además de otros. Se incuban los tubos a temperaturas adecuadas durante 24-48 horas. Pasado este tiempo realizar la lectura correspondiente. Tenga presente que: el medio color violeta tendrá pH neutro, el medio color amarillo tendrá pH ácido y el medio azul tendrá pH básico.

Prueba de Óxido/Fermentación (Prueba de Hugh-Leifson)

Con esta prueba se investiga si el microorganismo actúa sobre un azúcar por vía oxidativa o fermentativa. Se utiliza un medio agar nutritivo semisólido más glucosa al 1% y un indicador de pH, púrpura de bromocresol. Se prepara el medio semisólido, se funde al mechero y luego se distribuye en tubos de ensayo a razón de 7 ml por tubo. Se esteriliza en autoclave por 15 minutos a 121ºC.

1. El medio neutro tiene un color violeta.
2. El medio ácido tiene color amarillo.
3. El medio básico tiene un color azulado-púrpura.

Antes de sembrar el medio se debe regenerar; el medio se calienta a baño maría hasta ebullición y luego se enfría rápidamente en agua fría con hielo, esto se realiza para extraer todo el oxígeno que pueda contener el medio.

Una vez realizada la regeneración del medio, se siembran los tubos por picadura, con un asa en punta, el microorganismo a estudiar. Se siembran dos tubos, uno de los cuales se cubre con 2 ml de parafina líquida estéril, con el propósito de crear un ambiente anaerobio. Se incuba a una temperatura de 37ºC durante 24 a 48 horas. Transcurrido este tiempo, se realiza la lectura.

Tubo Abierto / Tubo Cerrado / Mecanismo de Acción

• Amarillo / Violeta / Oxidativo
• Amarillo / Amarillo / Fermentativo
• Violeta / Violeta / No actúa

Escherichia coli es un microorganismo fermentativo.

Pseudomonas aeruginosa es un microorganismo que no actúa fermentativamente ni oxidativamente sobre la glucosa, dado que no la utiliza como fuente de carbono.

Medios de Cultivo Diferenciales

Agar Tres Azúcares Hierro (TSI)

Es un medio diferencial para la identificación de enterobacterias según la fermentación de tres azúcares (lactosa, sacarosa y glucosa) y producción de ácido sulfhídrico, además de gas.

La degradación del azúcar con formación de ácido se detecta por el viraje a amarillo del indicador, mientras que la alcalinización vira a rojo violeta. Si solo se degrada la glucosa, la producción de ácido es débil y en la superficie se evapora el dióxido de carbono producido por la oxidación de la glucosa, y el microorganismo utiliza las peptonas, quedando el medio de color rojo violeta y en el fondo, en cambio, el medio permanece de color amarillo, debido a que se ha seguido la fermentación de la glucosa, lo que produce ácidos fuertes no volátiles.

Si se degrada la lactosa y la sacarosa, la producción de ácido es intensa, y todo el medio (fondo y superficie) quedan amarillos. La producción de gas se detecta por la formación de burbujas, y eventualmente un agrietamiento del agar.

La producción de ácido sulfhídrico, ya sea a partir del tiosulfato, como de los aminoácidos azufrados de las peptonas, se detecta por la formación de precipitados negros de sulfuro de hierro cuando reacciona el ácido sulfhídrico producido con las sales de hierro del medio. El medio se utiliza en tubos inclinados, con fondo abundante y una cuña corta, que se siembra en estría en la superficie y picadura en el fondo.

Resultados

• K/A = Superficie alcalina sobre fondo amarillo ácido
• A/A = Superficie ácida amarilla sobre fondo ácido amarillo
• R/R = El medio no sufre cambios
• K/K = Superficie alcalina sobre fondo alcalino
• K/R = Superficie alcalina sobre fondo sin cambio

Agar Hierro Lisina (LIA)

Es un medio diferencial que permite la identificación de enterobacterias, siendo especialmente útil en la diferenciación de Salmonella y Proteus. Se basa en la reacción de descarboxilación del aminoácido lisina, o bien en la desaminación de este aminoácido, y la producción de ácido sulfhídrico.

Este medio se encuentra preparado comercialmente por firmas comerciales como Difco y Merck. Su composición la puede ver en el envase o en manuales de medios de cultivo. El medio contiene glucosa (dextrosa), que es rápidamente fermentada por el microorganismo, produciendo acidificación con lo que aparece una coloración amarilla en el medio. En las siguientes horas de incubación, los microorganismos que son capaces de descarboxilar la lisina producen alcalinización en el medio, con lo cual el color amarillo que se había formado, se transforma en un color violeta, debido a que el indicador pasa a su forma básica. La producción de ácido sulfhídrico queda evidenciada por la aparición de una coloración negra en el tubo.

Clave

• K = alcalinización (color morado violeta)
• A = acidificación (color amarillo)
• R = rojo (color rojo, desaminación de la lisina)
• + = sulfatorreductora
• – = no reductora del sulfato

Técnica: Se siembran los microorganismos a estudiar, Proteus y Salmonella, por picadura hasta el fondo del tubo y por estría en la superficie de la cuña. Se deja incubar durante 24 horas a 37ºC.

Pruebas IMViC

Son un conjunto de cuatro pruebas bioquímicas que sirven para caracterizar bacterias de los diferentes géneros que existen en la naturaleza, como por ejemplo Escherichia coli, Salmonella, Proteus, Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter freundii, etc. Estas cuatro pruebas son Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato.

Prueba del Indol

Se determina la capacidad de un microorganismo para producir Indol a partir de la molécula de triptófano, presente en el caldo peptonado, a través de la enzima triptofanasa. El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar 3 metabolitos indólicos principales: Indol, escatol e indolacético. Diversas enzimas intracelulares que intervienen en este proceso reciben el nombre colectivo de triptofanasa, lo que implica un complejo sistema de enzimas vinculadas a la producción de Indol.

El medio de cultivo para realizar esta prueba es agua peptonada (rica en triptófano); la peptona se agrega al 1%.

Se distribuye en tubos de hemólisis a razón de 3 ml y de 5 ml en tubos de ensayo según se utilice y se esteriliza en autoclave durante 15 minutos a 121ºC.

Se siembran los microorganismos problemas y se incuban a la temperatura adecuada durante 48 horas.

La lectura se realiza con el reactivo de Kovacs, cuya composición es la siguiente:

• p-dimetilaminobenzaldehído 5 g
• Alcohol isoamílico 75 ml
• HCl concentrado 25 ml

Se disuelve el aldehído en alcohol, luego se añade lentamente el ácido. Se filtra si es necesario. Si se produce Indol, se formará un complejo con el aldehído, de color rojo. El HCl es para favorecer la formación del complejo, que ocurre a pH ácido. El alcohol amílico es para concentrar el color en la superficie del tubo.

• Anillo rojo en la superficie del tubo …………………. Indol +
• Si no se presenta coloración ………………………….. Indol –

Escherichia coli es Indol +, Enterobacter aerogenes es Indol -.

Prueba del Rojo de Metilo

Se basa en el empleo de un indicador de pH, rojo de metilo, para determinar la concentración de iones hidrógeno presente cuando una bacteria cataboliza la glucosa.

Con esta prueba se investiga si el microorganismo actúa por la vía ácido mixta sobre los azúcares; esta es una vía metabólica en la que se producen ácidos del tipo fórmico, acético, láctico y succínico (ácidos muy fuertes dentro de la debilidad de los ácidos orgánicos).

Se utiliza el medio de cultivo Caldo Rojo de Metilo/Voges-Proskauer (RM/VP).

Este medio es líquido y se prepara y distribuye a razón de 5 ml por tubo de ensayo y se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

La lectura se realiza agregando solución de rojo de metilo, en solución alcohólica al 0,2% (p/v).

Una vez que se siembra y se deja incubar por 48 horas, se leen los resultados. Si el microorganismo ha producido ácidos a partir de la glucosa, se mantendrá rojo el indicador.

• Medio ácido, indicador rojo RM+
• Medio neutro, indicador amarillo naranja RM-

Escherichia coli es RM +, Enterobacter aerogenes es RM -.

Prueba de Voges-Proskauer

La reacción de VP se basa en la detección del acetilmetilcarbinol (acetoína) a partir de la fermentación butanodiólica de la glucosa.

Las bases bioquímicas de la prueba consideran que a partir del ácido pirúvico, una bacteria puede seguir vías metabólicas diferentes para la obtención de energía, según la composición de su sistema enzimático. Una de estas vías es la fermentación butanodiólica, cuyo producto final es el 2,3 butanodiol, en que la acetoína es su precursor. La prueba de VP se basa en la detección de este último metabolito.

La acetoína que se produce en la fermentación cuando reacciona con el hidróxido de potasio (al 40% p/v) es oxidada a diacetilo, el que a su vez reacciona con los grupos guanidínicos de la arginina, que está presente en las peptonas que constituyen el medio, dando una coloración rojiza.

Para esta prueba se utiliza el mismo medio que se usa para la prueba del rojo de metilo.

Se siembra el microorganismo problema y se incuba a 37ºC durante 48 horas.

La lectura se realiza agregando al cultivo 6 a 8 gotas de una solución de KOH al 40% y luego 1 ml de solución alcohólica de alfa naftol al 5% (p/v). Se debe esperar hasta 20 minutos para realizar la lectura, tiempo en el cual se deja en la estufa el cultivo con los reactivos agregados.

La formación de un anillo rosa fluorescente en la superficie del tubo indica que la prueba es positiva.

Escherichia coli es VP -, Enterobacter aerogenes es VP +.

Prueba del Citrato

Con esta prueba se determina si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono para el metabolismo, provocando una alcalinización en el medio.

Los microorganismos que utilizan el citrato tienen la enzima citrato permeasa, que permite el paso del citrato a través de la membrana celular.

El medio a utilizar para esta prueba es el Kocer Citrato (líquido) o Citrato de Simons (sólido e inclinado en tubo). Estos medios contienen citrato como única fuente de carbono, sales minerales y, además, un indicador de pH, el azul de bromotimol. El medio en un principio es de color verde y cuando un microorganismo utiliza el citrato ocurre una alcalinización del medio, variando de verde a azul.

• Color azul en el medio, prueba del citrato +
• Color verde en el medio, prueba del citrato –

Medio Movilidad, Indol y Ornitina (MIO)

Es un medio diferencial que se utiliza para la identificación de enterobacterias en base a su movilidad, actividad de la enzima ornitina descarboxilasa y producción de indol. El medio de cultivo se encuentra preparado comercialmente y se suspende a razón de 31 gramos por litro de medio. Se calienta hasta ebullición para la disolución de los componentes, se distribuye en tubos de ensayo a razón de 5 ml por tubo y se esteriliza en autoclave a 121ºC por 15 minutos. Se deja solidificar en posición vertical.

Como se trata de un agar semisólido, la movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o un crecimiento que difunde desde la línea de inoculación. La reacción de la ornitina se indica mediante un color púrpura en todo el medio; este color puede variar en intensidad y puede blanquearse a un color pálido debido a la reducción del indicador. La reacción se debe a que el organismo fermenta la dextrosa del medio, reduciendo su pH; esta condición ácida origina que el indicador púrpura de bromocresol se vuelva amarillo y proporcione las condiciones óptimas para la descarboxilación de la ornitina. Si ocurre esta reacción, el pH sube como resultado y el indicador se vuelve púrpura. Los cultivos negativos a la ornitina producen un tubo amarillo que puede ser púrpura en la parte superior. Los microorganismos a probar en este medio se siembran por picadura, y se deja incubar durante 24 horas a la temperatura adecuada.

Fermentación de la Lactosa

Sirve para diferenciar organismos fermentadores de la lactosa y no fermentadores de la misma.

Para esta prueba se utiliza el medio agar MacConkey, el cual es un medio diferencial que contiene sales biliares, rojo neutro, lactosa y cristal violeta. La acción diferencial de este medio se basa en la fermentación de la lactosa. Las colonias de organismos que fermentan este carbohidrato producen una caída localizada del pH, lo cual, seguido por la absorción del rojo neutro, imparte un color rojo a la colonia. Las colonias de organismos que no fermentan la lactosa permanecen incoloras y traslúcidas.

El medio se encuentra preparado comercialmente y se prepara según las instrucciones que se indica en el envase.

Este medio es ampliamente utilizado para aislar e identificar selectivamente enterobacterias como Salmonellas, Shigellas y coliformes a partir de heces, orinas, aguas negras y diversos alimentos.

La selectividad se debe a la presencia de cristal violeta y de sales biliares que inhiben casi o completamente el crecimiento de organismos Gram positivos.

Urocultivo. Aislamiento sobre MacConkey. Colonias lactosa-positivas y lactosa-negativas.