La ingeniería genética se basa en la modificación del genotipo de los organismos. Involucra la obtención de un gen de interés y su introducción en un organismo huésped. Sus objetivos son:
- Obtener individuos que sinteticen productos de interés comercial.
- Obtener individuos mejor adaptados a ciertas condiciones ambientales.
La ingeniería genética depende de un conjunto de técnicas que involucran:
- Clonación de genes.
- Generación de moléculas de ADN recombinante.
- Introducción a una célula huésped.
- Síntesis del nuevo producto en la célula huésped.
En síntesis, la manipulación del ADN y de proteínas.
Clonación Molecular
Técnica que se basa en la reproducción de miles de copias de un mismo gen o fragmento de ADN por medio de la replicación. Utiliza un vector de clonamiento que en general es un plásmido modificado o artificial. La replicación se realiza dentro de una bacteria, la que generará millones de copias de la secuencia problema. El vector plasmidial debe contener:
- Un origen de replicación independiente.
- Un fuerte promotor de replicación.
- Marcador de resistencia.
- Un sitio Polilinker.
También son usados como vectores fagos y cósmidos.
- Los bacteriófagos son virus que infectan exclusivamente a bacterias.
- Los cósmidos son vectores híbridos utilizando partes del cromosoma de lambda y de plásmidos.
Cósmidos como vectores de clonamiento:
- Derivados del fago λ, sin regiones codificantes.
- Permite el clonamiento de grandes fragmentos de ADN.
- La presencia de sitios cos permite su encapsulamiento in vitro.
- La infección (transducción) es más eficiente que la transformación.
- Se mantiene como plásmido en E. coli.
Vector de Expresión:
- Promotor.
- Terminador.
- Sitio de unión a ribosoma (en procariotas).
- Sitios únicos de corte de enzimas.
- Marcadores genéticos.
- Origen de replicación.
- Tamaño pequeño.
El nivel de expresión depende del promotor y del número de copias del vector de expresión
Número de copias del vector de expresión:
Depende del origen de replicación que tenga, puede ir desde una copia hasta cerca de 100 (1-4: bajo número de copia; 10-100: alto número de copia).
Promotores Constitutivos:
Siempre están transcribiéndose.
Regulables:
Se mantienen apagados y son inducidos por algún cambio en el medio (inductor, cambio de T).
Fuerza del promotor:
Determina el nivel de transcripción.
Aplicaciones de la clonación molecular:
- Producción de proteínas recombinantes.
- Secuenciación de fragmentos de ADN.
- Terapia génica.
- Producción de sondas de ADN.
- Diagnóstico y tratamiento de enfermedades.
- Producción de vacunas.
- Producción de plantas mejoradas genéticamente.
- Desarrollo de la Biotecnología.
Electroforesis
Técnica que consiste en la separación de biomoléculas a través de un campo eléctrico de acuerdo a tamaño, forma y propiedades topológicas. Se realiza en una matriz gelatinosa denominada gel, cuya función es semejante a la de un tamiz. Las moléculas migran hacia un polo positivo al final del gel.
Electroforesis: Aparatos y tipos de Geles
- Gel Horizontal (Geles Submarinos) – ADN y ARN – Geles Agarosa
- Bromuro de etidio
- Gel Red
- SYBR Green
- Gel Vertical – Geles Poliacrilamida – Generalmente para geles de secuenciación.
- Geles de Campo Pulsado / Pulse Field Gel – Electroforesis que usa más de un campo eléctrico – Geles de Agarosa – ADN genómico grandes (Cromosomal).
SDS: solubiliza los fosfolípidos y proteínas de membrana permitiendo la lisis.
NaOH: desnaturaliza ADN cromosomal, plasmidial y proteínas. No exceder tiempo de exposición.
RNAsa: presente digiere ARN eficientemente durante lisis alcalina.
Pptado: complejos de ADN cromosomal, proteínas y restos celulares producidos por exceso de sal y SDS.
Nucleasas:
Las nucleasas son enzimas que producen la ruptura de los enlaces fosfodiéster de la cadena polinucleotídica de los ácidos nucleicos.
Existen 2 tipos de nucleasas:
- Exonucleasa: Remueven nucleótidos uno a uno desde los extremos de las moléculas de ADN (Nucleasa BAL31, E. coli Exonucleasa III).
- Endonucleasas: Rompen enlaces fosfodiéster dentro de la molécula de ADN (S1 Nucleasa, Mung Bean Nucleasa, DNAsa).
Exonucleasas:
- Exonucleasa III – 3′ a 5′ actividad exonucleasa – Para ADN de doble hebra (ds), inicia en roturas (nicks) – deleciones nested, sondas ssADN, o secuenciación.
- Exonucleasa VII – 3′ a 5′ o 5′ a 3′ dirección – específica para ss – No libera Mononucleótidos.
- Exonucleasa Lambda – 5′ a 3′ dirección – Exonucleasa para ds, no puede iniciar en roturas (nicks).
Endo- y Exonucleasas
- Nucleasa Bal31 – Altamente específica para actividad endodesoxinucleasa ss – Actividad Exonucleasa capaz de degradar simultáneamente extremos 3′ y 5′ de ds ADN.
- Neurospora Crassa Nucleasa – En ssADN o ARN: actúa como una endonucleasa – En dsADN (y ssADN): actúa como una exonucleasa.
Enzimas de Restricción
O endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiéster del material genético a partir de una secuencia que reconocen (4 a 8 pb). Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias). Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, por ejemplo EcoRI proviene de E. coli; BamHI de Bacillus amyloliquefaciens; etc. Permiten cortar ADN de doble hebra, donde reconocen secuencias palindrómicas.
Aplicaciones de las enzimas de restricción:
- Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en Southern y Northern blotting.
- Generación de fragmentos para ser clonados en vectores apropiados, creación de ADN recombinante.