Clasificación de los Métodos de Separación de Proteínas en Función de sus Propiedades
- Tamaño molecular: diálisis, ultracentrifugación, ultrafiltración, cromatografía de exclusión molecular.
- Solubilidad: precipitación selectiva, punto isoeléctrico, temperatura, por salado, por solventes.
- Carga eléctrica, polaridad: electroforesis, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de adsorción.
Métodos por Solventes
Disminuye el grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la proteína, baja la constante dieléctrica, provoca la desnaturalización, agregación y precipitación. Los disolventes orgánicos interaccionan con el interior hidrofóbico y desorganizan la estructura terciaria.
Consideraciones para la Extracción y Purificación de Proteínas
- Un método específico y sensible para distinguir y medir cuantitativamente la proteína a aislar.
- Un procedimiento para liberar la proteína en forma soluble sin perder actividad.
- Localizar en qué organela se encuentra.
- Aplicar métodos de fraccionamiento.
Etapas de la Purificación de Proteínas
Extracción
De menor a mayor resolución. Ejemplos: precipitación isoeléctrica, fraccionamiento por salado, precipitación con disolventes (en cada etapa debe determinarse el factor de enriquecimiento).
Cristalización
Si la purificación es elevada, puede cristalizarse, estableciendo previamente su homogeneidad por electroforesis o ultracentrifugación.
Métodos para Determinar el Peso Molecular (PM) de las Proteínas
Utilizando presión osmótica, efecto de dispersión de la luz, por la composición química, ultracentrifugación, electroforesis, cromatografía de exclusión molecular, microscopía electrónica, espectroscopía de masa, tamiz molecular.
Determinación del PM por Espectroscopía de Masa
Convierte a las macromoléculas en iones gaseosos por bombardeo electrónico y, haciendo uso de campos eléctricos y/o magnéticos, son separados según el valor de su relación m/z, obteniéndose así información de su PM.
Caracterización de la Proteína
PM, cadenas peptídicas que la componen, PM de cada cadena, su composición de aminoácidos, estudios conformacionales.
Dicroísmo Circular
Es un indicador sensible de la conformación de la cadena principal de la proteína.
Técnica Espectroscópica de Absorción
Fuente de luz polarizada (UV-VIS) aplicable a muestras ópticamente activas.
Teoría de Dicroísmo Circular
Un rayo de luz polarizado en un plano puede considerarse formado por dos componentes polarizados circularmente, uno a la derecha y el otro a la izquierda. Estos componentes están en fase y son de la misma amplitud.
Cristalografía por Rayos X
Revela la estructura tridimensional con detalles atómicos.
Difracción de Rayos X
Nivel de resolución de 0.2 nm. Los sólidos cristalinos ocasionan una difracción tridimensional de los rayos X incidentes si la longitud de onda de la radiación es del mismo orden de magnitud que las distancias interatómicas.
Aspectos Generales de las Enzimas
Aumenta la velocidad de reacción sin consumirse, no afecta el equilibrio de reacción, alta especificidad, eficacia en pequeña cantidad.
Centro Activo
Región que se une al sustrato, comprende: a) sitio de unión formado por aminoácidos, b) sitio catalítico formado por aminoácidos, c) se encuentran aminoácidos como serina, cisteína y lisina. Disminuye la energía de activación, el sustrato se une en forma óptima para que la reacción se produzca, modifica propiedades químicas del sustrato (debilitándolo).
Modelos Sustrato-Enzima
- Llave-cerradura (estructuras son complementarias, encajan perfectamente).
- Ajuste inducido (el centro activo adopta la conformación idónea en presencia del sustrato).
Nomenclatura de Enzimas
- Particulares.
- Sistemática (tipo de reacción + «asa»).
- Código de la Comisión de Enzimas (identificación por código numérico, letras EC + 4 números separados por puntos; 1er número: clase, 2do número: subclases, 3er y 4to número: grupos químicos específicos).
Clasificación de Enzimas
Oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas, ligasas.
Factores que Afectan la Reacción Enzimática
Concentración del sustrato, concentración de la enzima, pH y temperatura.
Cofactores Enzimáticos
Sustancias no proteicas, termoestables, unidas a enzimas. Clasificación: coenzimas (holoenzima = enzima + coenzima), activadores (metales, monovalentes y divalentes), grupo prostético (fuertemente unido a la enzima, transportador de grupos funcionales).
Inhibidores Enzimáticos
- Competitivos (ocupan temporalmente el centro activo por semejanza estructural).
- No competitivos (alteran la conformación espacial de la enzima, impidiendo la unión con el sustrato).
Actividad Enzimática
Cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 micromol de sustrato en 1 minuto (u/ml o katal).
Fórmula de la Actividad Enzimática
(S2 – S1) / (T2 – T1)
Coeficiente de Absorción Molar
Absorbancia a una determinada longitud de onda de una solución 1M de la sustancia en una cubeta de 1 cm a 25 °C.