Niveles de Bioseguridad y Microorganismos Asociados

La bioseguridad se clasifica en cuatro niveles, según el riesgo de los microorganismos:

• Nivel 1: No causan enfermedades en humanos.
• Nivel 2: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Cryptosporidium parvum, Candida albicans, Aspergillus.
• Nivel 3: Patógenos que pueden causar enfermedades graves en la colectividad, como virus, Mycobacterium tuberculosis, Taenia solium.
• Nivel 4: Patógenos que no tienen profilaxis ni tratamiento.

Instrumental de Laboratorio en Microbiología

• Asa de siembra
• Hilo de siembra
• Pipeta Pasteur
• Pipeta de vidrio

Técnicas de Tinción en Microbiología

Tinción Simple

Utiliza un solo colorante. Se usa, por ejemplo, para la observación de hongos.

Tinción Diferencial

Emplea dos o más colorantes. Ejemplos:

• Tinción de Gram: Diferencia bacterias en Gram positivas (violeta) y Gram negativas (rosa).
• Tinción de Ziehl-Neelsen: Diferencia bacterias ácido-alcohol resistentes (rojo) de las no resistentes (azul).

Conceptos adicionales:

• Pleomorfismo: Diferentes formas en una misma especie bacteriana.
• Tinción simple de levaduras: Se utiliza azul de metileno.
• Gram+: Pared celular con ácido teicoico y una capa gruesa de peptidoglicano.
• Gram-: Pared celular con un espacio periplásmico y una capa delgada de peptidoglicano.

Procedimiento de la Tinción de Gram:

1. Cristal violeta (colorante primario)
2. Lugol (mordiente)
3. Acetona/alcohol (decolorante)
4. Safranina (colorante de contraste)

La diferenciación se basa en la estructura de la pared celular, específicamente en el peptidoglicano. Ejemplos:

• Gram+: Lactobacillus acidophilus, Streptococcus, Bacillus cereus (fucsia/violeta).
• Gram-: Escherichia coli (rosa).

Microorganismos en Alimentos

Lactobacillus acidophilus y Streptococcus thermophilus se utilizan en la producción de yogur.

Movilidad Bacteriana

Se observa en fresco, con bacterias vivas, sin teñir ni fijar, utilizando solución salina. La luz intensa puede inactivar el movimiento. Se distingue entre:

• Movimiento pasivo
• Movimiento activo

Tinción de Esporas

Se utiliza verde de malaquita como colorante primario (que penetra en la espora) y safranina como colorante de contraste para las células vegetativas. Las esporas pueden ser:

• Centrales
• Subterminales
• Terminales deformantes (ej. Clostridium botulinum)

Tinción de Micelios

Se emplea azul de lactofenol. Ejemplos de morfología:

• Aspergillus: Estructura similar a una flor.
• Penicillium: Estructura similar a una escoba.
• Mucor: Estructura similar a pequeñas setas o piruletas.

Resistencia microbiana: Desde mayor a menor resistencia: priones > virus con cápsula.

Microbiota Saprófita

Biota Residente

Permanente, profunda, actúa como defensa de la piel. Puede estar asociada a infecciones postquirúrgicas o procedimientos invasivos. No se elimina fácilmente con métodos mecánicos como el lavado. Ejemplos: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Corynebacterium, levaduras.

Biota Transitoria

No permanente, superficial, adquirida por contacto. Puede incluir microorganismos inocuos o patógenos. Fácil transmisión, implicada en infecciones cruzadas. Ejemplos: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, hongos, parásitos y virus.

Medios de Cultivo

Contienen nutrientes en concentraciones adecuadas, condiciones físicas óptimas, fuentes de carbono, nitrógeno, minerales y otros factores de crecimiento, además de AGUA. Son medios químicamente definidos.

• Líquidos: Agua de peptona o caldo nutritivo (CN).
• Sólidos: Agar nutritivo.
• Semisólidos: Para pruebas bioquímicas.
• Enriquecidos: Agar sangre (permite observar la hemólisis: gamma-hemolíticas no hidrolizan, alfa-hemolíticas hidrolizan parcialmente, beta-hemolíticas hidrolizan completamente).
• Selectivos:
  • McConkey (crecen Gram- y no Gram+, diferencia lactosa +/-).
  • Manitol salado (crece solo Gram+).
  • Agar Sabouraud (solo hongos).
• Diferenciales: Agar sangre, agar manitol salado, agar CLED (crece todo, diferencia lactosa +/-).

Siembra: Se realiza por aislamiento por estría en superficie (agotamiento del asa).

Microorganismos (MO) Marcadores y Alterantes

MO Marcadores

• Índice: Sugieren la posible presencia de patógenos.
• Indicadores: Indican un procesado inadecuado.

Ejemplos: Anaerobios, Enterobacteriaceae, Escherichia coli.

MO Alterantes

Pseudomonas, bacterias lácticas y no lácticas, Clostridium, mohos y levaduras.

Pruebas Bioquímicas

• Ureasa: Indica la hidrólisis de la urea. El indicador de pH cambia de naranja a rosa (positivo). Ejemplos: Escherichia coli y Salmonella (-), Proteus y Klebsiella (+).
• Oxidasa: Detecta la presencia de citocromo C oxidasa. Positivo: azul (Pseudomonas), Negativo: sin cambio de color (Escherichia coli).
• Coagulasa: Para la identificación de Staphylococcus. Formación de un coágulo (gel) indica Staphylococcus aureus, mientras que la ausencia de coágulo (líquido) sugiere Staphylococcus epidermidis.
• Catalasa: Detecta la presencia de catalasa, que descompone el peróxido de hidrógeno (H₂O₂). Positivo: burbujas (Staphylococcus y Bacillus), Negativo: sin burbujas (Streptococcus y Clostridium).
• DNAsa: Detecta la presencia de nucleasas que despolimerizan el ADN. Positivo: halo transparente alrededor de la colonia (Staphylococcus aureus), Negativo: sin halo (Staphylococcus epidermidis).
• Rojo de Metilo: Para bacterias entéricas. Cambio de amarillo a rojo indica la producción de ácidos orgánicos (pH < 4.3). Si permanece amarillo, no hay producción de ácidos orgánicos.
• Kliger Iron Agar (KIA): Evalúa la fermentación de glucosa (rojo-amarillo), la fermentación de lactosa (rojo-amarillo) y la producción de H₂S (precipitado negro). Si no hay precipitado negro, no se produce H₂S. Ejemplos: Negativo: Pseudomonas, Positivo: Escherichia coli, Salmonella (lactosa +).

Cálculo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC)

N = C x D x 10 ufc/ml o N = C x 10 x 10 ufc/g

Donde:

• N = Número de UFC
• C = Media del número de colonias
• D = Inversa de la dilución o factor de dilución

Ejemplo: C = media de colonias x dilución normal (1/100) = UFC x 10 = UFC/ml x 10 = UFC/g

Técnicas de Diagnóstico Microbiológico

Diagnóstico Directo

Detecta el agente infeccioso.

Diagnóstico Indirecto

Detecta la respuesta inmune del huésped.

ELISA (Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas)

• ELISA Indirecto: Se recubre la placa con antígenos. Se añade la muestra (que contiene anticuerpos). Se añade un conjugado (anticuerpo anti-Ig + enzima). Se produce una reacción enzimática. Se añade el sustrato. Se cuantifica la reacción (color/no color).
• ELISA Directo: Se recubre la placa con anticuerpos. Se añade la muestra (que contiene antígenos).
• Título de un ELISA: Dilución más próxima al límite de detección del aparato, pero que lo supera.
• Azul = Positivo, Blanco = Control Negativo.
• Técnica cuantitativa y cualitativa.

Microscopía Electrónica (ME)

Utiliza sales de metales pesados. Permite observar la morfología de los virus.

Inmunomicroscopía Electrónica (InmunoME)

Utiliza anticuerpos específicos marcados con metales pesados para detectar virus.

Hibridación

Utiliza sondas de ácidos nucleicos marcadas radiactivamente o con enzimas.

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Utiliza la enzima Taq polimerasa. Amplificación exponencial: 2ⁿ, donde n es el número de ciclos.

RT-PCR (PCR con Transcriptasa Inversa)

El ARN extraído se convierte en ADN complementario (ADNc) mediante la transcriptasa inversa. El ADNc sirve como molde para la reacción de PCR.

Técnicas Serológicas

Detectan anticuerpos en suero, determinando el título y el tipo. Permiten identificar el agente causal, el proceso de la enfermedad y el nivel de infección en la población. La seroconversión (aumento del título de anticuerpos en 4 veces) indica infección activa. Ejemplos:

• ELISA y RIA (Radioinmunoensayo): Fijación de antígenos. Similar al ELISA, pero con un contador de centelleo.
• Inmunofluorescencia Indirecta: Antígeno fijado con acetona + Anticuerpos de la muestra + Unión + Anticuerpo anti-IgG marcado con isotiocianato de fluoresceína + Unión + Observación con luz ultravioleta.
• Inmunofluorescencia Directa: Antígeno + Anticuerpos fluorescentes.
• Western Blot: Utiliza reactivos marcados para detectar virus.

Identificación de Protozoos y Helmintos

Protozoos

• Entamoeba histolytica (humano).

Helmintos

• Gohelmintos:
  • Nematodos: Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura.
  • Platelmintos Trematodos (Duelas): Fasciola hepatica (huésped intermediario: vaca), Fasciolopsis buski (huésped intermediario: cerdo).

Morfología:

• Trofozoíto: Forma vegetativa.
• Quiste: Forma de resistencia.
• Ascaris lumbricoides: Macho con gancho y extremo posterior redondeado, huevo decorticado.
• Enterobius vermicularis: Aletas cefálicas, bulbo esofágico, cola en punta, huevo convexo/plano.
• Trichuris trichiura: Extremo anterior delgado, huevo en forma de limón con tapones en los extremos.
• Fasciola hepatica: Cono apical, muchas ramas en el aparato digestivo, ventosas separadas, huevos con opérculo (tapa).
• Fasciolopsis buski: Sin cono apical, aparato digestivo bifurcado sin ramas, ventosas juntas.
• Helmintos Nematodos: Anisakis (pez, huésped intermediario: humano), Trichinella spiralis (huésped intermediario: cerdo), ciclo autoheteroxeno.
• Cestodos (Tenias): Taenia solium (huésped intermediario: cerdo), Taenia saginata (huésped intermediario: vaca).
• Helmintos Platelmintos Trematodos Digenea (Duelas): Clonorchis sinensis (humano).
• Protozoo Apicomplejo: Toxoplasma gondii (gato, huésped intermediario: humano).
• Taenia solium: Menos de 14 ramas uterinas. Causa teniasis y cisticercosis.
• Taenia saginata: Más de 14 ramas uterinas. NO causa cisticercosis humana, solo teniasis.
• Clonorchis sinensis: Más estrecho en el extremo apical, aparato digestivo bifurcado.
• Toxoplasma gondii: Ooquistes (con 2 esporoquistes y 4 esporozoítos cada uno), pseudoquistes (con taquizoítos) y quistes (con bradizoítos).