Microorganismos en la Industria Farmacéutica

Antibióticos

Los antibióticos son sustancias químicas elaboradas por microorganismos, hongos y bacterias, que matan o inhiben el crecimiento de otros microorganismos, principalmente bacterias. Muchos antibióticos son producidos por hongos filamentosos de los géneros Penicillium y Aspergillus, y por bacterias del grupo de los actinomicetos, del género Streptomyces.

Los antibióticos se usan con fines terapéuticos en el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por bacterias. La acción de los antibióticos se basa en su capacidad para inhibir reacciones bioquímicas esenciales y específicas de las bacterias, pero no de las células humanas (por ejemplo, la penicilina inhibe la síntesis de peptidoglucano de la pared celular bacteriana). Algunos de los antibióticos más comunes producidos industrialmente son: eritromicina, penicilina, estreptomicina, tetraciclina, cefalosporina, etc.

Algunos antibióticos, denominados de amplio espectro, son efectivos frente a un gran número de agentes infecciosos, mientras que otros son muy específicos contra un solo tipo bacteriano.

En la actualidad, ciertas mutaciones génicas han originado bacterias resistentes a uno o varios antibióticos. La resistencia bacteriana a antibióticos origina la pérdida de acción de estos medicamentos y consiguientes problemas de salud pública.

Vacunas y Esteroides

Las vacunas se obtienen a partir de microorganismos patógenos atenuados o inactivados, de sus toxinas o de alguno de sus componentes moleculares.

Los esteroides se consiguen mediante un proceso denominado bioconversión o biotransformación. Durante este proceso, los microorganismos pueden convertir un compuesto precursor, como los esteroles o compuestos relacionados, en esteroides como la cortisona, estrógenos y progesterona.

Microorganismos en la Industria Alimentaria

Las levaduras son los microorganismos más empleados en los procesos industriales alimentarios, generalmente mediante fermentaciones. Se emplean cepas de la levadura Saccharomyces cerevisiae, usada desde la antigüedad en la fabricación de vino y cerveza. Cultivadas en grandes fermentadores, las células de levadura se emplean en la producción de alcohol y bebidas alcohólicas, en la elaboración de pan y como fuente de alimento, de vitaminas y de factores de crecimiento. En el caso del vino, sidra y otras bebidas alcohólicas, las levaduras fermentan los azúcares presentes en los zumos de frutas, como uvas, manzanas, etc., produciendo alcohol. Las mismas levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae se utilizan también en la elaboración de pan; durante este proceso, los azúcares de la harina son fermentados convirtiéndose en etanol y CO₂, que hace que la masa se esponje; ambos productos de la fermentación, alcohol y CO₂, desaparecen durante la cocción del pan. Por otra parte, en el caso de la producción de yogur, queso y otros derivados de la leche, se emplean otros microorganismos, principalmente bacterias del ácido láctico. Mediante fermentación láctica, estas bacterias consumen la lactosa de la leche y producen ácido láctico, que disminuye el pH lo que provoca la coagulación de las proteínas de la leche, formando la cuajada por una parte, y el suero por otra. En la elaboración de queso, tras la obtención de la cuajada, esta se deja madurar, sometida a la acción de levaduras, hongos y/o bacterias.

Biorremediación

La biorremediación es el empleo de organismos para eliminar o neutralizar contaminantes en el suelo o en el agua. En los procesos de biorremediación se pueden utilizar plantas (fitorremediación), microorganismos (biorremediación microbiana) o enzimas producidas por bacterias (biorremediación enzimática). En el caso de la biorremediación mediante microorganismos, las aplicaciones son muy numerosas, por ejemplo: tratamiento de residuos industriales, eliminación de pesticidas, insecticidas o herbicidas del suelo, eliminación de metales pesados como plomo, mercurio… y eliminación de hidrocarburos como los vertidos de petróleo causantes de las mareas negras.

Técnicas de Ingeniería Genética

1. Tecnología del ADN Recombinante

La tecnología del ADN recombinante permite la creación de moléculas de ADN recombinante mediante la unión de fragmentos de ADN procedentes de organismos diferentes. Su principal finalidad es la clonación celular de fragmentos de ADN, es decir, la obtención de copias idénticas de un fragmento de ADN de interés, introduciéndolo en células hospedadoras, generalmente bacterias, para que se replique dentro de ellas. Al unir el fragmento que nos interesa con el ADN que lo va a transportar a la célula hospedadora, se obtiene un ADN recombinante. El fragmento de ADN se denomina inserto y la molécula de ADN a la que se une se denomina vector.

ADN recombinante = Inserto + Vector

Esta técnica es posible gracias a determinadas enzimas endonucleasas, denominadas enzimas de restricción, que son capaces de romper los enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos en determinadas regiones. Las enzimas de restricción poseen una gran especificidad, ya que reconocen y cortan en secuencias concretas de ADN, de cuatro u ocho bases, denominadas sitios de reconocimiento o de restricción. Los sitios de restricción suelen ser secuencias palindrómicas, es decir, se leen igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha, y actúan como dianas para las enzimas de restricción. Estas cortan las dos cadenas de ADN y suelen dejar extremos cohesivos o pegajosos cuando el corte se produce escalonado y se generan extremos con bases desapareadas, denominados extremos cohesivos. Hay diferentes endonucleasas de restricción, producidas por distintas bacterias. En estas células, las enzimas actúan como mecanismo de defensa contra los virus bacteriófagos, detectando el ADN del fago y rompiéndolo mediante estas “tijeras moleculares”. En condiciones apropiadas, en presencia de la enzima ADN ligasa, dos moléculas de ADN cortadas con la misma enzima de restricción que deje extremos cohesivos pueden unirse de modo permanente, al interaccionar y aparearse las bases de sus extremos; la ADN ligasa, cataliza la formación del enlace fosfodiéster.

Procedimiento de clonación celular de ADN mediante tecnología del ADN recombinante:

1. Preparación del vector y del gen de interés: como vectores de clonación pueden usarse plásmidos, genomas víricos, etc. Vector e inserto se cortan con la misma enzima de restricción, que deje extremos cohesivos.
2. Formación del ADN recombinante: el inserto y el vector se unen mediante la ADN ligasa.
3. Introducción en células hospedadoras: el ADN recombinante se introduce en células hospedadoras con el fin de que se replique en ellas.
4. Replicación del ADN recombinante: el vector tiene capacidad de replicación independiente, lo que aumenta el número de copias del inserto.
5. Proliferación celular: las células se cultivan en un medio adecuado.
6. Selección: se seleccionan las células que han incorporado el ADN recombinante. Por ejemplo, si el vector lleva el gen de resistencia a determinado antibiótico, añadiendo este antibiótico se eliminan las células que no lo llevan.
7. Expresión del gen: si la finalidad de la clonación es la obtención de la proteína codificada por el inserto, se realiza la expresión del mismo para obtener la proteína de interés en grandes cantidades.

Vectores de Clonación

Los vectores de clonación tienen capacidad para replicarse de manera independiente del genoma de la célula hospedadora. Además, deben poseer uno o más genes marcadores que permitan seleccionar fácilmente las células hospedadoras que han incorporado el ADN recombinante. Los vectores de clonación pueden ser plásmidos, bacteriófagos, cósmidos o cromosomas artificiales.

Los plásmidos son moléculas de ADN circular de doble cadena, extracromosómico, presentes en las bacterias, que tienen la capacidad de replicarse independientemente del cromosoma principal. Puede haber muchos plásmidos en una célula bacteriana. Normalmente, presentan genes de resistencia a antibióticos que facilitan su detección y la selección de los clones que los contienen. En la naturaleza se transfieren de una bacteria a otra por conjugación a través de los pili; en el laboratorio, pueden introducirse en las bacterias por transformación por calor o por electroporación.

Los bacteriófagos, o fagos, son virus que parasitan a bacterias. El más usado es el fago λ. Se emplean cuando el fragmento de ADN que se quiere clonar es de mayor tamaño que el que puede transportar un plásmido. Normalmente se sustituyen algunos genes víricos por el ADN que se quiere clonar, originando un fragmento recombinante que se introduce en la cápsida del fago. Los fagos como vectores pueden llevar insertos de mayor tamaño que los plásmidos y además son mucho más eficientes penetrando en las células hospedadoras.

Recientemente se han empleado como vectores de clonación moléculas sintéticas creadas en laboratorio como los cósmidos o los cromosomas artificiales. Los cósmidos son vectores sintéticos que combinan las ventajas de los plásmidos y del fago λ. Se trata de moléculas de ADN circular extra-cromosómico sintetizadas a partir de un plásmido, que combinan características de plásmidos y fagos. Los cósmidos son híbridos entre plásmidos y el fago λ. Por un lado, poseen la habilidad del plásmido para replicarse autónomamente en las células, contienen el origen de replicación y los genes de resistencia a los antibióticos de su plásmido parental. Por el otro, contienen los sitios cos del fago λ para empaquetamiento in vitro. Los cromosomas artificiales, como los YAC (Cromosomas artificiales de levaduras) permiten clonar grandes segmentos de ADN eucariota.

2. Electroforesis en Gel

La electroforesis es una técnica de separación de moléculas en función de su movilidad, sometidas a un campo eléctrico. Normalmente, la electroforesis se realiza para separar fragmentos de ADN (molécula que presenta cargas negativas en sus grupos fosfato, ionizados) sobre un soporte de un gel de agarosa. La agarosa es un polisacárido que en disolución forma un gel semisólido constituido por una matriz tridimensional que ofrece resistencia al avance de las moléculas, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamaño se desplazan con más rapidez; de esta forma, la electroforesis separa los fragmentos de ADN según su tamaño o longitud. Para deducir el tamaño de los fragmentos de ADN de la muestra, se emplean marcadores moleculares.

3. Hibridación de Ácidos Nucleicos

La hibridación es el proceso de formación de moléculas de ADN con dos cadenas de diferente origen, o ADN híbrido. Ocurre cuando dos cadenas complementarias se ponen en contacto, ambas de ADN, o una de ADN y otra de ARN. La hibridación se emplea para identificar en una muestra de ADN una secuencia de nucleótidos conocida, denominada secuencia diana. Para localizar la secuencia diana se utiliza una sonda, es decir, un fragmento de ADN o ARN marcado química o radiactivamente que contiene la secuencia complementaria de la secuencia diana. Para ello, primero debe desnaturalizarse el ADN por calor, separando las dos cadenas originales, que posteriormente se ponen en contacto con la sonda que se unirá en aquellas zonas en las que aparezcan secuencias complementarias a ella.

4. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una técnica de amplificación del ADN in vitro, es decir, un método de clonación acelular de moléculas de ADN, cuyo objetivo es conseguir múltiples copias de un gen o fragmento de ADN. Para realizar una PCR se necesitan, además del ADN de interés que se quiere clonar, cebadores o primers, nucleótidos trifosfato de A, T, C y G y una ADN polimerasa termoestable (estable a altas temperaturas, normalmente procedentes de arqueobacterias).

El procedimiento básico de la PCR se repite en varios ciclos en los que primero se realiza la desnaturalización del ADN por calor, posteriormente se unen los cebadores y finalmente se replica el ADN:

• En la primera fase de cada ciclo se realiza la desnaturalización del ADN: se aumenta la temperatura de la muestra que contiene el ADN de interés hasta los 68-98ºC durante 30-120 segundos, logrando la separación de las dos cadenas del ADN.
• Posteriormente, se realiza la hibridación con los cebadores: al bajar la temperatura a 37-65ºC durante 10-120 segundos, los cebadores se unen a las cadenas simples de ADN.
• A continuación, la temperatura se mantiene estable a unos 72-75ºC durante 1-3 minutos, en los que ocurre la replicación del ADN: tomando como moldes las dos cadenas de ADN, la ADN polimerasa termoestable realiza la replicación, mediante elongación de los cebadores.

Todas las fases anteriores constituyen un ciclo que se repite muchas veces de modo automático en instrumentos denominados termocicladores, obteniéndose finalmente múltiples copias del ADN de interés en un tiempo relativamente corto. La PCR resulta de gran utilidad ya que permite obtener miles de copias de un pequeño fragmento de ADN en poco tiempo. Se emplea, por ejemplo, para amplificar ADN en pruebas de paternidad, detección prenatal de enfermedades, detección de material genético vírico o bacteriano durante enfermedades infecciosas, etc.

El ADN de interés que se someterá a PCR se obtiene mediante procesos de aislamiento a partir de las muestras que lo contengan. En ocasiones, las muestras originales no contienen ADN si no ARN, que habrá que someter a un proceso de retrotranscripción. Por ejemplo, en el caso de detección de virus cuyo material genético es ARN, como la gripe. En estos casos, tras la retrotranscripción o transcripción inversa, se obtiene el ADN complementario al genoma vírico para poder someterlo a PCR.

5. Genotecas

Una genoteca, o biblioteca de ADN, es una colección de fragmentos de ADN clonados. Las genotecas tienen múltiples aplicaciones, como la conservación de muestras del genoma de organismos para estudios posteriores, el aislamiento de genes y secuencias determinadas implicados en patologías; además, son el punto de partida para la búsqueda de genes de interés para su posterior clonación, secuenciación, expresión, etc. Hay dos tipos de genotecas: genotecas genómicas y genotecas de ADNc.

Las genotecas genómicas contienen el ADN total (tanto las secuencias que se expresan como las que no) de un organismo de interés. Las genotecas de ADNc representan el conjunto de genes que se están expresando en un organismo, tejido o célula determinada o en una situación o momento concreto.

6. Secuenciación del ADN

La secuenciación de ADN consiste en determinar la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN.

7. CRISPR-Cas. Edición de Genes

El término CRISPR se refiere a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas, presentes en el ADN de las bacterias; en estas, forma parte de un sistema defensivo natural contra las infecciones víricas. Se trata de unos genes bacterianos que codifican para unas proteínas Cas, que se encargan de la defensa de la bacteria frente a infecciones víricas. Cuando un virus infecta una bacteria, le inyecta su ADN; la bacteria responde produciendo su enzima Cas, que corta en trozos el ADN vírico e incorpora a su genoma los fragmentos de ADN del virus. Pero no los incorpora al azar, sino entre las secuencias CRISPR. Posteriormente, los fragmentos de ADN viral se transcriben y se obtienen ARNs que las proteínas Cas usan como guías para identificar y degradar ácidos nucleicos virales en infecciones posteriores.

Actualmente, se puede emplear el sistema CRISPR-Cas9 como técnica de edición génica que permite cortar el ADN en un sitio específico y editarlo, es decir, permite reescribir la secuencia de nucleótidos de cualquier gen. Este procedimiento también se conoce como mutagénesis dirigida.